基于線粒體DNA多態(tài)性鑒定海魚種類.pdf

1、在煙臺(tái)地區(qū)漁業(yè)生產(chǎn)中，海魚商品生產(chǎn)在當(dāng)?shù)啬酥辽綎|省漁業(yè)經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。一些商家為了追求較高的商業(yè)利潤(rùn)，在海魚產(chǎn)品捕撈、加工處理、市場(chǎng)流通等環(huán)節(jié)中，存在以次充好及魚種標(biāo)簽混亂等問題。在生活實(shí)踐中，人們一般依據(jù)形態(tài)特征對(duì)魚種進(jìn)行鑒別，但有些魚種之間的外形特征較為相似，難以區(qū)分。如果魚肉產(chǎn)品經(jīng)過加工、尤其是深加工后，其種類來源更難以確認(rèn)。本研究旨在建立一種簡(jiǎn)便準(zhǔn)確的海魚種類鑒別方法，為魚肉制品的溯源和安全監(jiān)管提供技術(shù)支持。
　　首先

2、，提取10種海魚的基因組DNA；然后，根據(jù)GenBank中發(fā)布的DNA序列，參照相關(guān)文獻(xiàn)，利用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)控制合成線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ（COⅠ）和亞基Ⅲ（COⅢ）基因的通用引物，對(duì)10種魚樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)檢測(cè)純化后克隆、測(cè)序；第三，將測(cè)序結(jié)果輸入NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性檢索，并比較分析COⅠ和COⅢ序列，探討各種魚種間分子系統(tǒng)學(xué)關(guān)系，對(duì)COⅢ序列是否適宜作為分子標(biāo)記、是否適宜作為海洋魚類DNA條形碼的潛在序列

3、進(jìn)行了簡(jiǎn)要評(píng)價(jià)；第四，依據(jù)測(cè)序結(jié)果，利用Primer5.0軟件對(duì)10種魚的COⅠ和COⅢ2個(gè)基因分別進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切分析，最終選用NlaⅢ和HinfⅠ2種內(nèi)切酶進(jìn)行酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，獲得10種海魚的COⅠ、COⅢ2個(gè)基因的特異酶切片段圖譜；最后，依據(jù)測(cè)序結(jié)果，利用DNAMAN軟件對(duì)10種魚的COⅠ、COⅢ2個(gè)基因分別進(jìn)行序列比對(duì)，在堿基序列差異較大的區(qū)域設(shè)計(jì)各魚種特異引物，進(jìn)行物種特異性PCR擴(kuò)增，并嘗試組合部分魚種特

4、異引物進(jìn)行復(fù)合PCR擴(kuò)增。
　　研究結(jié)果表明，設(shè)計(jì)的通用引物能有效地?cái)U(kuò)增出COⅠ和COⅢ兩個(gè)靶基因片段。尤其對(duì)各魚種COⅢ基因片段的擴(kuò)增產(chǎn)物通過測(cè)序、比對(duì)分析，獲得了NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)中迄今未見報(bào)道的高眼鰈(Cleisthenes herzensteini)和中間低鰭鯧(Peprilus medius)相應(yīng)的COⅢ基因序列，確認(rèn)了所研究的鯧魚為鯧科、低鰭鯧屬（Peprilus）的中間低鰭鯧（Peprilus medius），而非

5、長(zhǎng)鯧科（Centrolophidae）的刺鯧（Psenopsis anomala）、或鯧屬(Pampus)的銀鯧（Pampus argenteus）或灰鯧、鐮鯧等本地鯧。
　　選用COⅠ、COⅢ基因作為條形碼鑒定的魚種均與形態(tài)學(xué)鑒定的魚種吻合；COⅢ基因具有種間變異較大、種內(nèi)相對(duì)保守的特征，同樣可以作為分子標(biāo)記鑒定海魚種類；采用PCR-RFLP技術(shù)能有效地區(qū)分以上10種海魚，限制性內(nèi)切酶NlaⅢ在10種魚的COⅠ基因上具有豐富的酶

6、切位點(diǎn)，用該種酶的單酶切即可將10種魚進(jìn)行有效的區(qū)分；研究發(fā)現(xiàn)，在對(duì)COⅢ基因利用PCR-RFLP技術(shù)分析時(shí)，有些魚種會(huì)產(chǎn)生不同的酶切圖譜，表明COⅢ基因不適合用作高階元的分類標(biāo)記，推測(cè)其可能更適合于用作物種內(nèi)不同群體間遺傳分化的分子標(biāo)記。
　　依據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)的各魚種的特異引物特異性強(qiáng)，在適宜的退火溫度下，只有目標(biāo)魚種有特異的擴(kuò)增條帶，其他非目標(biāo)魚種沒有擴(kuò)增條帶；另外，采用復(fù)合PCR方法，以COⅠ或COⅢ基因?yàn)闃?biāo)記，實(shí)現(xiàn)了在一個(gè)