甘肅野生與栽培甘草內(nèi)生菌有效菌株發(fā)酵物與宿主抗炎作用的對(duì)比研究.pdf

1、目的：植物內(nèi)生菌在與宿主植物寄生過(guò)程中可以產(chǎn)生與宿主相同或相似的藥理活性的成分。本課題旨在觀察甘草內(nèi)生菌有效菌株與甘草水煎液、總黃酮、總皂苷抗炎作用差異，為研究甘草內(nèi)生菌與其宿主抗炎作用的相關(guān)性及發(fā)現(xiàn)甘草新藥源提供依據(jù)。
　　方法：1.通過(guò)結(jié)合MTT法檢測(cè)對(duì)不同濃度LPS刺激小鼠巨噬細(xì)胞（RAW264.7）的毒性大小和采用Griess法檢測(cè)不同濃度LPS刺激RAW264.7細(xì)胞上清液中NO的含量，篩選出最佳炎癥模型的LPS濃度，為

2、接下來(lái)體外抗炎實(shí)驗(yàn)做鋪墊。2.采用“Z”字劃線法和五點(diǎn)法分別在NA、PDA固體培養(yǎng)基上對(duì)栽培甘草內(nèi)生細(xì)菌和栽培甘草內(nèi)生真菌分別進(jìn)行分離和純化，直到得到純凈的菌種，標(biāo)記為栽培甘草各自的菌株。栽培甘草內(nèi)生細(xì)菌為JTZB001、JTZB002、JTZB003…，栽培甘草內(nèi)生真菌為JTZF001、JTZF002、JTZF003…。進(jìn)行栽培甘草內(nèi)生菌發(fā)酵液與宿主水煎液、總黃酮、總皂苷體對(duì)LPS致RAW264.7分泌炎癥因子NO、TNF-α、IL-

3、6影響的實(shí)驗(yàn)研究。3.采用“Z”字劃線法和五點(diǎn)法分別在NA、PDA固體培養(yǎng)基上對(duì)野生甘草內(nèi)生細(xì)菌和野生甘草內(nèi)生真菌分別進(jìn)行分離和純化，直到得到純凈的菌種，標(biāo)記為野生甘草各自的菌株。其中野生甘草內(nèi)生細(xì)菌為JTYB001、JTYB002、JTYB003…，野生甘草內(nèi)生真菌為JTYF001，JTYF002，JTYF003…。進(jìn)行野生甘草內(nèi)生菌發(fā)酵液與宿主水煎液、總黃酮、總皂苷體對(duì)LPS致RAW264.7分泌炎癥因子NO、TNF-α、IL-6影

4、響的實(shí)驗(yàn)研究。4.通過(guò)甘草內(nèi)生菌發(fā)酵液與宿主水煎液、總黃酮、總皂苷對(duì)肺炎小鼠血清中的TNF-α、IL-6的含量影響，篩選出體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中最終與甘草有效成分相近藥效的抗炎作用的有效菌株。
　　結(jié)果：1.體外實(shí)驗(yàn)中，確定RAW264.7炎癥模型最佳造模所需的LPS濃度為10μg/mL。2.從栽培甘草中分離出了77株內(nèi)生菌，其中內(nèi)生細(xì)菌63株，分別為JTZB001、JTZB002、JTZB003…JTZB063，內(nèi)生真菌14株JTZF001

5、、JTZF002、JTZF003…JTYF014。與栽培甘草水煎液、栽培甘草總黃酮、栽培甘草總皂苷比較，ZB006和ZB016的抑制作用較強(qiáng)(P<0.05)；與栽培甘草水煎液相比，栽培甘草總黃酮組抑制TNF-α的作用強(qiáng)，且抑制強(qiáng)度高于栽培甘草內(nèi)生菌各有效菌株(P<0.05)；與栽培甘草總黃酮組相比，其成倍的高于各有效菌株的抑制作用(P<0.05)；宿主組的抑制作用普遍高于有效菌株組(P<0.05)。3.從野生甘草中共分離出了63株內(nèi)生菌

6、，其中內(nèi)生細(xì)菌31株，分別為JTYB001、JTYB002、JTYB003…JTYB031，內(nèi)生真菌32株，分別為JTYF001、JTYF002、JTYF003…JTYF032。與野生甘草水煎液組、野生甘草總黃酮組、野生甘草總皂苷組相比，JTYF027與之無(wú)差異，表明其抑制分泌作用無(wú)差異； JTYB018的TNF-α分泌量與野生甘草總皂苷比，強(qiáng)于皂苷組(P<0.05)；JTYB018的NO和IL-6的分泌與野生甘草水煎液組、野生甘草總黃

7、酮組、野生甘草總皂苷組相比沒(méi)有差異，即抗炎作用與之相近。4.體內(nèi)抗炎即肺炎小鼠實(shí)驗(yàn)中，測(cè)得血清中炎癥因子含量栽培甘草水煎液相比，JTZB014和JTYB018組分泌的IL-6與之的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，JTZB006、JTZB016、JTZB018、ZB062與之無(wú)差異；TNF-α的分泌量有效菌株組與宿主組無(wú)差異。
　　結(jié)論：1.栽培甘草內(nèi)生菌有效菌株及其宿主水煎液、總黃酮、總皂苷對(duì)LPS致RAW264.7分泌炎癥因子

8、的影響：各組均能抑制RAW264.7炎癥因子NO、TNF-α、IL-6的分泌，綜合比較JTZB006、JTZB014、JTZB016、JTZB018、JTZB062的作用均弱于宿主各組，但有效菌株中ZB006、ZB016作用相對(duì)較強(qiáng)。2.野生甘草內(nèi)生菌有效菌株及其宿主水煎液、總黃酮、總皂苷對(duì)LPS致RAW264.7分泌炎癥因子影響：各組均能抑制RAW264.7炎癥因子NO、TNF-α、IL-6的分泌，綜合比較JTYB018、JTYF02