甘肅野生與栽培甘草內(nèi)生菌有效菌株發(fā)酵物與宿主及藥效成分抑菌活性對(duì)比研究.pdf

1、目的：研究有效菌株發(fā)酵物、宿主水煎液、總黃酮、總皂苷對(duì)金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌的抑菌活性，并比較有效菌株與宿主間的抑菌活性差異，為解決甘草野生資源匱乏和尋找甘草藥效成分替代品提供理論依據(jù)。
　　方法：1.采用劃線法和五點(diǎn)法分別用NA和PDA培養(yǎng)基分離甘草內(nèi)生細(xì)菌和真菌，通過菌餅法篩選對(duì)金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌具有抑菌作用的甘草內(nèi)生菌。
　　2.采用超聲提取的方法，以提取溫度、提取時(shí)間、料液比、乙醇濃度

2、為考察因素，分別以總黃酮和總皂苷含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別優(yōu)選出野生及栽培甘草總黃酮及總皂苷的最佳提取工藝。
　　3.通過測(cè)定各甘草內(nèi)生菌有效菌株發(fā)酵物、宿主水煎液、總黃酮、總皂苷的抑菌圈直徑和采用二倍稀釋法測(cè)定其最小抑菌濃度（MIC），比較甘草內(nèi)生菌有效菌株與宿主水煎液、總黃酮、總皂苷間的體外抑菌活性差異。
　　4.通過給小鼠灌胃給藥20株甘草內(nèi)生菌有效菌株發(fā)酵物、甘草水煎液、總黃酮、總皂苷，4d

3、后腹腔注射金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌和大腸桿菌菌懸液，觀察甘草內(nèi)生菌有效菌株發(fā)酵物、宿主水煎液、總黃酮、總皂苷對(duì)感染小鼠的保護(hù)作用，比較甘草內(nèi)生菌有效菌株與宿主水煎液、總黃酮、總皂苷間的體內(nèi)抑菌活性差異。
　　結(jié)果：1.內(nèi)生菌的分離及有效菌株的篩選：野生甘草中分離出了63株內(nèi)生菌，其中內(nèi)生細(xì)菌31株（JTYB001~JTYB031），內(nèi)生真菌32株（JTYF001~JTYF032）；栽培甘草中分離出了77株內(nèi)生菌，其中內(nèi)生細(xì)菌63

4、株（JTZB001~JTZB063），內(nèi)生真菌14株（JTZF001~JTYF014）。通過菌餅法，從分離到的140株內(nèi)生菌中初步篩選出20株具有抑菌活性的有效菌株，其中對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用的內(nèi)生菌有18株：JTYB006、029，JTYF023，JTZB002、005、006、014、016、018、020、043、054、058、059、060、062、063，JTZF011；對(duì)肺炎鏈球菌有抑制作用的內(nèi)生菌有3株：JTZB00

5、5、043，JTZF014；對(duì)大腸桿菌有抑制作用的內(nèi)生菌有3株：JTYB012，JTZB018、020。
　　2.甘草總黃酮提取工藝研究：(1)甘草總黃酮：B提取時(shí)間>A提取溫度>C乙醇濃度>D料液比，四個(gè)因素都有顯著性意義，最佳提取工藝為B3A3C2D1；(2)甘草總皂苷：A提取溫度>C乙醇濃度>D料液比>B提取時(shí)間，A提取溫度、C乙醇濃度和D料液比有顯著性意義，最佳提取工藝為A2C3D1B2；
　　3.體外抑菌實(shí)驗(yàn)：各組

6、對(duì)金黃色葡萄球菌均有抑菌活性(P<0.01)，各有效菌株抑菌活性均弱于宿主；有效菌株中JTZB059、JTYB029抑菌活性相對(duì)較強(qiáng)，最小抑菌濃度分別為0.1250 g/mL、0.0625 g/mL；宿主中野生、栽培甘草總黃酮抑菌活性相對(duì)較強(qiáng)。各組對(duì)肺炎鏈球菌均有抑菌活性(P<0.01)；與栽培甘草水煎液、總皂苷比較，JTZB005抑菌活性較強(qiáng)(P<0.01)，最小抑菌濃度0.0625 g/mL；有效菌株中JTZB005抑菌活性相對(duì)較強(qiáng)

7、，宿主中栽培甘草總黃酮抑菌活性相對(duì)較強(qiáng)。各組對(duì)大腸桿菌均有抑菌活性(P<0.01)；與栽培甘草水煎液、總黃酮比較，JTZB018抑菌活性較強(qiáng)(P<0.01)，最小抑菌濃度0.1250g/mL；有效菌株中JTZB018抑菌活性相對(duì)較強(qiáng)，宿主中野生、栽培甘草總黃酮抑菌活性相對(duì)較強(qiáng)。
　　4.體內(nèi)抑菌實(shí)驗(yàn)：對(duì)感染金黃色葡萄球菌小鼠的影響，JTYB029和JTZB002、005、006、014、020、043、058、060、063及各水

8、煎液、各總黃酮、各總皂苷具有保護(hù)作用（P<0.05或P<0.01）；TYB029和JTZB002、005、006、058及各水煎液、各總黃酮、各總皂苷平均存活時(shí)間3天（P<0.01）；JTZB014、020、043、060、063平均存活時(shí)間2天（P<0.05或P<0.01）。對(duì)感染肺炎鏈球菌小鼠的影響，JTZB005、043、各水煎液、各總黃酮、各總皂苷均有保護(hù)作用（P<0.05或P<0.01）；JTZB005、野生甘草水煎液、各總黃

9、酮、各總皂苷平均存活時(shí)間3天（P<0.01）；JTZB043、栽培甘草水煎液平均存活時(shí)間2天（P<0.01）。有效菌株發(fā)酵物對(duì)感染大腸桿菌小鼠無保護(hù)作用。
　　結(jié)論：1.從野生甘草中分離出了63株內(nèi)生菌，從栽培甘草中分離出了77株內(nèi)生菌，說明甘草內(nèi)生菌具有自身種類多樣性。
　　2.超聲提取結(jié)合正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)用于總黃酮、總皂苷的提取，該工藝簡單、方便、快捷。
　　3.部分甘草內(nèi)生菌具有與宿主相同或相似的抑菌活性。