紅色毛癬菌對角質(zhì)形成細胞VDR與IL-10、IL-12表達的影響及相關關系的實驗研究.pdf

1、目的：
　　有研究顯示，人類對紅色毛癬菌普遍易感，全球90％的皮膚癬菌病是由紅色毛癬菌引起的，發(fā)病高峰集中在夏季，大多不引起明顯的炎癥反應,而呈現(xiàn)為慢性遷延病程，嚴重影響著患者生活質(zhì)量[1]。
　　維生素D是一類固醇類衍生物，可對人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生重要的影響，其作用越來越受到人們的關注[2]，維生素D通過與維生素D受體(VDR)結(jié)合發(fā)揮生理作用。VDR屬于類固醇激素/甲狀腺激素受體超家族成員，是一種配體依賴的核轉(zhuǎn)錄因子。

2、>　　皮膚是機體內(nèi)所需維生素D的重要源泉，可以在太陽光的照射下由皮膚內(nèi)儲備的前體物質(zhì)維生素D3原轉(zhuǎn)化而來。維生素D的活性形式1,25(OH)2D3，在夏季血清水平較冬季為高，夏季維生素D的存貯有一個上升趨勢，這可導致前炎癥因子的下降，從而導致機體對病原微生物產(chǎn)生免疫耐受。
　　IL-12是一種異二聚體促炎因子，可通過誘導γ干擾素的產(chǎn)生、促進Th1細胞的分化，起到強大的促炎癥作用[3]。IL-10可對多種免疫細胞的生物活性及這些細胞

3、釋放的細胞因子的生物效應產(chǎn)生抑制作用，其生理功能就是限制和終止炎癥反應。因此，IL-10在限制宿主對病原菌的免疫過程中起重要作用[4,5]。本實驗通過紅色毛癬菌體外刺激角質(zhì)形成細胞，檢測VDR與IL-10、IL-12的表達并對其表達水平進行相關分析，進而探討紅色毛癬菌感染過程中是否通過VDR信號途徑介導機體對紅色毛癬菌的免疫耐受導致疾病慢性遷延。
　　方法：
　　1實驗用細胞的培養(yǎng)
　　HaCaT細胞購自上海賽笠生物科

4、技有限公司編號：MXC138。
　　HaCaT細胞的培養(yǎng)使用90%DMEM+10%FBS+1%青鏈霉素混合劑配制而成的完全培養(yǎng)基。將HaCaT細胞制成單細胞懸液后，進行細胞爬片，培養(yǎng)5天后，取出爬片，丙酮固定，進行HE染色及免疫組織化學SP法檢測HaCaT細胞角蛋白10的表達。
　　2實驗用菌株
　　實驗菌株采用河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院真菌室保存菌種。
　　3菌株的培養(yǎng)及菌懸液的配制
　　將紅色毛癬菌在PDA上

5、活化三次，28℃培養(yǎng)7—14天。加入含0.1%吐溫80的無菌水，吹打混合均勻，然后用組織研磨器將菌懸液研磨，血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整濃度為4-6×105CFU/mL。
　　4實驗分組與處理
　　實驗分為對照組和實驗組。
　　將HaCaT細胞培養(yǎng)1周后取出，棄原培養(yǎng)基，PBS洗滌3遍后，用0.25%胰蛋白酶將細胞從培養(yǎng)瓶底部消化下來，加入完全培養(yǎng)基終止消化，離心所收集到的細胞，用完全培養(yǎng)基調(diào)終濃度至1-2×106/mL，轉(zhuǎn)種

6、到24孔培養(yǎng)板中。繼續(xù)培養(yǎng)24小時后行分組處理。實驗組每孔中加入濃度為4-6×105CFU/mL的菌懸液1mL，對照組每孔加入1mL含0.1%吐溫80無菌水1mL。依次在2h、4h、8h、16h采集實驗組和對照組的上清液。-20℃凍存待測。每個時間點均設3個平行孔。
　　5 ELISA法測各組IL-10、IL-12的分泌水平
　　復溫實驗組和對照組所收集到的上清液，依照所購買試劑盒使用指南，分別測定細胞培養(yǎng)上清液中的IL-1

7、0、IL-12表達水平。
　　6 Western blot法測各組 VDR的表達水平
　　PBS溶液清洗長有HaCaT細胞的24孔板，刮下細胞轉(zhuǎn)移至EP管內(nèi)，離心后添加裂解液RIPA裂解細胞，提取總蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至 PVDF膜，脫脂牛奶封閉完成之后，分別孵育 VDR(1:1000)與β-actin(1:1000)一抗及山羊抗兔/小鼠IgG二抗(1:3000)，最后用雙色紅外激光掃描儀進行掃膜，Image

8、J軟件分析結(jié)果。
　　7統(tǒng)計學分析
　　SPSS13.0統(tǒng)計學分析軟件，所得結(jié)果以均數(shù)±標準差表示，組間比較所使用的統(tǒng)計學方法是單因素方差分析,組內(nèi)不同時間點的兩兩比較所使用的統(tǒng)計學方法為SNK-q檢驗，VDR與IL-10、IL-12的相關性分析所使用的統(tǒng)計學方法為Pearson相關分析法，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1 HaCaT細胞培養(yǎng)的形態(tài)學觀察
　　倒置顯微鏡下觀察，細胞生長狀態(tài)良

9、好，多數(shù)細胞貼壁，折光性強，圓形，細胞膜完整并且向外伸出2至3個偽足。5天后細胞呈現(xiàn)多角形，融合成片，外觀呈鋪路石樣排列。HaCaT細胞HE染色結(jié)果可見其胞質(zhì)豐富，呈粉紅色，核大呈藍紫色。免疫組化結(jié)果顯示HaCaT細胞的角蛋白10在胞膜及胞質(zhì)中呈陽性表達。
　　2上清液IL-10表達水平的ELISA法測定結(jié)果
　　在實驗的2h、4h、8h、16h，實驗組IL-10表達水平分別為1427.71±15.952、1562.09±1

10、2.24、1826.57±16.12、2363.807±53.465pg/mL，IL-10的表達水平隨著時間的延長而增加。對照組在2h、4h、8h、16h的IL-10表達水平分別為1100.58±2.46、1160.8±7.044、1285.07±5.185、1400.96±11.657pg/mL，IL-10的表達水平隨著時間的延長而增加。IL-10在實驗組的表達水平比對照組高，F(xiàn)=6.591，P=0.042(P<0.05)，差異有統(tǒng)計

11、學意義。
　　3上清液IL-12表達水平的ELISA法測定結(jié)果
　　在實驗的2h、4h、8h、16h，實驗組IL-12表達水平分別為296.85±0.6、285.43±2.03、275.19±6.03、249.18±3.72 pg/mL，IL-12的表達水平隨著時間的延長而減少。對照組在2h、4h、8h、16h的IL-12表達水平分別為294.85±4.601、317.36±7.026、340.123±18.905、385.

12、050±6.593 p g/mL，IL-12的表達水平隨著時間的延長而增加。實驗組的IL-12表達水平明顯低于對照的IL-12表達水平，F(xiàn)=7.012，P=0.038(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。
　　4 Western Blot法測人永生化角質(zhì)形成細胞(HaCaT)中VDR蛋白的表達水平
　　在實驗的2h、4h、8h、16h，實驗組VDR蛋白表達水平灰度比值分別為0.394±0.011、0.468±0.019、0.4

13、58±0.021、0.616±0.156。對照組在2h、4h、8h、16h的VDR蛋白表達水平分別為0.27±0.014、0.294±0.015、0.301±0.002、0.413±0.01。實驗組和對照組的VDR蛋白表達水平均隨時間的延長而表達增加，但實驗組VDR蛋白上升的水平高于對照組，F(xiàn)=8.404，P=0.027(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。
　　5紅色毛癬菌作用于HaCaT細胞后VDR的表達水平分別與IL-10、I

14、L-12的表達水平的相關分析結(jié)果
　　Pearson相關分析結(jié)果顯示VDR蛋白表達水平與IL-10表達水平呈正相關，r=0.955，P=0.045(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。VDR蛋白表達水平與IL-12表達水平呈負相關，r=-0.968,P=0.032(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論：
　　1紅色毛癬菌刺激角質(zhì)形成細胞后，IL-10的表達水平呈時間依賴性上升趨勢，IL-12的表達水平呈時間依賴性

15、下降趨勢。
　　2紅色毛癬菌刺激角質(zhì)形成細胞后，VDR蛋白表達呈時間依賴性上升趨勢。
　　3紅色毛癬菌刺激角質(zhì)形成細胞后，VDR表達與IL-10的表達呈正相關，而與IL-12的表達呈負相關。
　　綜上所述，紅色毛癬菌刺激角質(zhì)形成細胞后，隨作用時間的延長， VDR及IL-10表達上升，而IL-12表達下降。推測紅色毛癬菌可能通過VDR途徑促進角質(zhì)形成細胞分泌IL-10以及抑制IL-12表達，進而導致機體對紅色毛癬菌產(chǎn)生免