TLR2對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞與不同皮膚癬菌共孵育時(shí)的影響研究.pdf

1、第一部分角質(zhì)形成細(xì)胞對(duì)不同皮膚癬菌生長的抑制作用及封閉TLR2對(duì)其的影響
　　目的：
　　研究角質(zhì)形成細(xì)胞對(duì)紅色毛癬菌、犬小孢子菌及石膏樣小孢子菌生長的抑制作用以及封閉TLR2對(duì)上述作用的影響。
　　方法：
　　將培養(yǎng)在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中的角質(zhì)形成細(xì)胞在5%CO2、37℃環(huán)境下進(jìn)行孵育,當(dāng)細(xì)胞生長到80%左右時(shí)分為兩組,以無血清培養(yǎng)基配置的菌絲懸液(懸液濃度為4×105/ml)替代原培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)

2、為刺激組(即A組),阻斷組(即B組)則先加入TLR2抗體(使抗體濃度達(dá)到20ug/ml),37℃孵育1小時(shí)以阻斷TLR2的作用,再加入菌懸液,同時(shí)設(shè)立無細(xì)胞生長的培養(yǎng)基加入菌絲段懸液為空白對(duì)照。分別制備在不同時(shí)間點(diǎn)(4h、8h、16h和24h)共孵育后的菌絲段懸液,通過臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)法計(jì)算得出真菌的生長抑制率。
　　結(jié)果：
　　在角質(zhì)形成細(xì)胞和菌絲段懸液共孵育的不同時(shí)間點(diǎn),采用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)法檢測(cè)的結(jié)果為:紅色毛癬菌刺激組生

3、長抑制作用4h即顯現(xiàn),16h可達(dá)(67.8%±3.1%),封閉TLR2后的阻斷組生長抑制作用減弱,封閉前后生長抑制作用差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);刺激組犬小孢子菌4h生長抑制率為41.8%±2.5%,隨時(shí)間推移,16h達(dá)70.0%±6.8%,24h逐漸下降,封閉TLR2后的阻斷組在各時(shí)間點(diǎn)生長抑制作用均明顯下降,阻斷前后生長抑制作用差異皆有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);刺激組石膏樣小孢子菌隨共孵育時(shí)間的延長生長抑制作用逐漸加強(qiáng),24

4、h達(dá)63.0%±3.5%,封閉TLR2阻斷組4h生長抑制率為15.6%±1.7%,且各個(gè)時(shí)間點(diǎn)生長抑制作用均減弱,阻斷前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　角質(zhì)形成細(xì)胞與體外培養(yǎng)的親人性紅色毛癬菌、親動(dòng)物性犬小孢子菌及親土性石膏樣小孢子菌共孵育時(shí)對(duì)其均有抑制作用;阻斷TLR2后此抑制作用明顯減弱,TLR2在角質(zhì)形成細(xì)胞抑制不同皮膚癬菌生長的過程中產(chǎn)生重要的影響。
　　第二部分TLR2在不同皮膚癬菌感染

5、中對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子的影響
　　目的：
　　觀察紅色毛癬菌、犬小孢子菌及石膏樣小孢子菌與角質(zhì)形成細(xì)胞共孵育后炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-8及TNF-α的表達(dá)變化,以及中和TLR2前后上述因子的變化情況,探討TLR2在皮膚癬菌感染中發(fā)揮的作用。
　　方法：
　　角質(zhì)形成細(xì)胞與上述三種皮膚癬菌菌懸液分別共孵育,角質(zhì)形成細(xì)胞直接與懸液共孵育為刺激組(即A組),阻斷組(即B組)為先阻斷TLR2后角質(zhì)形成細(xì)胞再

6、與三種皮膚癬菌共孵育,采用酶聯(lián)免疫復(fù)合物法(ELISA)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞上清中IL-6、IL-8及TNF-α的濃度,比較中和TLR2抗體前后各種細(xì)胞因子的濃度變化情況,同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。
　　結(jié)果：
　　紅色毛癬菌刺激角質(zhì)形成細(xì)胞后刺激組IL-8濃度明顯升高,在各時(shí)間點(diǎn)分別與對(duì)照組、阻斷組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);刺激組IL-6及TNF-α濃度8h分泌明顯增加,且隨時(shí)間延長其濃度不斷升高,24h分別達(dá)(498.

7、133±20.159)pg/ml和(32.133±3.674)pg/ml,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),封閉TLR2阻斷組IL-6及TNF-α濃度下降,刺激組和阻斷組8h、16h和24h差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　犬小孢子菌刺激角質(zhì)形成細(xì)胞后IL-8表達(dá)量隨時(shí)間推移逐漸增多,4h濃度即可達(dá)到(542.867±37.846)pg/ml,24h升高到(671.358±26.247)pg/ml,阻斷TLR2

8、后則表達(dá)明顯降低,各時(shí)間點(diǎn)刺激組與對(duì)照組、刺激組與阻斷組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);刺激組IL-6、TNF-α在4h及8h時(shí)濃度無顯著變化,16小時(shí)后分泌量明顯增加,且隨時(shí)間推移逐漸增多,阻斷TLR2后各時(shí)間點(diǎn)IL-6、TNF-α表達(dá)降低,其中16h和24h時(shí)刺激組與阻斷組、刺激組與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　石膏樣小孢子菌刺激角質(zhì)形成細(xì)胞后刺激組IL-8濃度在各時(shí)間點(diǎn)均升高,分別與對(duì)照組及阻斷組之間

9、差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);刺激組IL-6不同時(shí)間點(diǎn)動(dòng)態(tài)表達(dá)量不同,4h和8h刺激組與對(duì)照組、刺激組與阻斷組比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),而在16h和24h時(shí)刺激組濃度分別可達(dá)到(38.70±8.41)pg/ml、(51.70±10.32)pg/ml,與阻斷組及對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);刺激組TNF-α濃度16h方升高明顯,24h達(dá)(40.61±5.94)pg/ml,與阻斷組及對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義