UVA對(duì)人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-10表達(dá)的影響及抗氧化劑、JNK抑制劑的干預(yù)研究.pdf

1、本研究通過(guò)體外培養(yǎng)的人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT‘細(xì)胞株)，探討UVA照射對(duì)人KC細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-10表達(dá)的影響，并分別以抗氧化劑(β-胡蘿卜素)、JNK抑制劑(SP600125)干預(yù)處理，揭示氧化應(yīng)激和JNK傳導(dǎo)通路在UVA誘導(dǎo)人KC細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-10表達(dá)中的作用。 實(shí)驗(yàn)方法 一、細(xì)胞培養(yǎng) HaCaT細(xì)胞以MEM培養(yǎng)基(內(nèi)含1‰非必需氨基酸、10％胎牛血清、100U/m

2、l青霉素、100mg/ml鏈霉素)于37℃、5％CO<,2>及飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞呈單層、亞融合狀態(tài)時(shí)，以0.25％胰蛋白酶消化，制成單個(gè)細(xì)胞懸液后傳代培養(yǎng)。 二、細(xì)胞活力 將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，37℃、5％CO<,2>及飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至約60％融合，棄培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，按100μl/孔加入PBS，以0～3.6 J/cm<'2>不同劑量的UVA照射細(xì)胞，MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞活力。待細(xì)胞培

3、養(yǎng)至約60％融合，向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為3μM的β-胡蘿卜素(DMSO溶解)，對(duì)照組和照射組加入等量DMSO。1h后棄培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，按100μl/孔加入PBS，以0～3.6 J/cm<'2>不同劑量的UVA照射干預(yù)組和照射組細(xì)胞，再按上述方法檢測(cè)各組細(xì)胞活力。 三、磷酸化JNK及非磷酸化JNK水平將細(xì)胞接種于預(yù)先置有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)2d，棄培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，按1.0ml/孔加入PBS，以2.4 J/

4、cm<'2>UVA照射細(xì)胞，分別于照射后0、2、4、12、24、48h采樣。對(duì)照組細(xì)胞不照射，其他處理同照射組。免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞磷酸化JNK和非磷酸化JNK水平。 按上述方法培養(yǎng)細(xì)胞。向干預(yù)組細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入終濃度為3μM的β-胡蘿卜素(DMSO溶解)，對(duì)照組和照射組加入等量DMSO。1h后棄培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，以1.0ml/孔加入PBS，照射組和干預(yù)組細(xì)胞以2.4．J/cm<'2>UVA照射，再按上述方法采樣并檢測(cè)各組

5、細(xì)胞磷酸化JNK和非磷酸化JNK水平。 四、TNF-α、IL-1β、IL-10 mRNA水平及蛋白表達(dá)將細(xì)胞接種于9.0cm平皿中培養(yǎng)，待細(xì)胞呈亞融合狀態(tài)，棄培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，按5.0ml/皿加入PBS，根據(jù)細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果，選擇2.4 J/cm<'2>作為UVA輻射劑量，分別于照射后0、2、4、12、24、48h收集細(xì)胞及上清液。對(duì)照組不照射，其他處理同照射組。RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-10

6、mRNA水平；ELISA方法檢測(cè)上清液中TNF-α、IL-1β、IL-10含量。 待細(xì)胞呈亞融合狀態(tài)，向干預(yù)組細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入終濃度為3μM的β-胡蘿卜素或10μM的SP600125(DMSO溶解)，對(duì)照組和照射組加入等量DMSO。1h后棄培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，按5ml/皿加入PBS，照射組和干預(yù)組細(xì)胞經(jīng)2.4/cm<'2>UVA照射，再按上述方法采樣并檢測(cè)各組細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-10 mRNA及蛋白水平。

7、 五、統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 一、細(xì)胞活力 3.0、3.6 J/cm<'2>UVA照射使細(xì)胞活力明顯降低(P<0.05)；2.4 J/cm<'2>及其以下劑量的UVA照射對(duì)細(xì)胞活力無(wú)明顯影響；β-胡蘿卜素預(yù)處理細(xì)胞后，各組細(xì)胞活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 二、磷酸化JNK及非磷酸化JNK水平2.4 J/cm<'2>

8、UVA照射HaCaT細(xì)胞后0～24h，磷酸化JNK及非磷酸化JNK水平均逐漸升高，24h達(dá)高峰，48h有所降低，但仍高于0～12h各檢測(cè)時(shí)點(diǎn)；對(duì)照組磷酸化JNK及非磷酸化JNK水平則隨著采樣時(shí)點(diǎn)延長(zhǎng)而逐漸升高，48h達(dá)高峰。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，照射組細(xì)胞磷酸化JNK水平在各采樣時(shí)點(diǎn)及非磷酸化JNK水平于0～2h及12～48h均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。 β-胡蘿卜素干預(yù)組細(xì)胞磷酸化JNK水平于照射后Oh基本同照射組，二者均明顯高

9、于對(duì)照組(P<0.05)；2h后干預(yù)組細(xì)胞磷酸化JNK水平明顯低于照射組(P<0.05)，24h后明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；β-胡蘿卜素干預(yù)組細(xì)胞非磷酸化JNK水平于0～48h均明顯低于照射組(P<0.05)，4～48h明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。 三、TNF-α、IL-1β、IL-10 mRNA水平及蛋白表達(dá) (一)TNF-α、IL-1β、IL-10 mRNA水平0～48h對(duì)照組細(xì)胞TNF-α、IL-1β m

10、RNA水平較平穩(wěn)；照射組細(xì)胞TNF-α、IL-1β mRNA水平于照射后0h開(kāi)始升高，2h達(dá)高峰，12h后恢復(fù)至對(duì)照組水平。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，O～4h照射組細(xì)胞TNF-α、IL-1β mRNA水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。 β-胡蘿卜素干預(yù)組細(xì)胞TNF-α、IL-1β mRNA水平于照射后0～48h基本同對(duì)照組，0～4h干預(yù)組及對(duì)照組細(xì)胞TNF-α、IL-1β mRNA水平均明顯低于照射組(P<0.05)，12～48h各組細(xì)胞

11、TNF-α、IL-1β mRNA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SP600125干預(yù)組細(xì)胞TNF-αmRNA水平于照射后0～48h均低于照射組，其中，0～4h及24～48h兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并于12～48h干預(yù)組細(xì)胞TNF-αmRNA水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；SP600125干預(yù)組細(xì)胞IL-1β mRNA水平于照射后0～48h均明顯低于照射組(P<0.05)，并于12～48h明顯低于對(duì)照組(P<0.0

12、5)。以2.4 J/cm<'2>UVA照射細(xì)胞后12h，IL-10 mRNA呈弱表達(dá)，照射組其他各檢測(cè)時(shí)點(diǎn)及對(duì)照組、β-胡蘿卜素和SP600125干預(yù)組細(xì)胞均未見(jiàn)IL-10 mRNA表達(dá)。 (二)TNF-α、IL-1β、IL-10蛋白表達(dá)0～48h對(duì)照組細(xì)胞TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)水平較平穩(wěn)；照射組細(xì)胞TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)水平于照射后0～4h基本同對(duì)照組，12h高于對(duì)照組，24h后恢復(fù)至對(duì)照組水平。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，

13、照射組細(xì)胞TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)水平于照射后12h明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。 β-胡蘿卜素干預(yù)組細(xì)胞TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)水平于照射后0～48h基本同對(duì)照組，干預(yù)組及對(duì)照組細(xì)胞TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)水平于12h明顯低于照射組(P<0.05)。SP600125干預(yù)組細(xì)胞TNF-α蛋白表達(dá)水平于0～48h均低于照射組和對(duì)照組，其中，12～48h明顯低于照射組(P<0.05)，24～48h明顯低于對(duì)照組(

14、P<0.05)。SP600125干預(yù)組細(xì)胞IL-1β蛋白表達(dá)水平于0～4h基本同對(duì)照組和照射組，12h明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，但明顯低于照射組(P<0.05)，24～48h明顯高于照射組和對(duì)照組(P<0.05)。 以2.4 J/cm<'2>UVA照射細(xì)胞后24h，培養(yǎng)液中可檢測(cè)到較低水平的IL-10蛋白，照射組其他各檢測(cè)時(shí)點(diǎn)及對(duì)照組、β-胡蘿卜素和SP600125干預(yù)組細(xì)胞均未檢測(cè)到IL-10蛋白表達(dá)。 結(jié)論

15、 3.0 J/cm<'2>及其以上劑量的UVA照射使體外培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞活力明顯降低，β-胡蘿卜素對(duì)UVA誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞活力下降具有拮抗作用。 2.4．J/cm<'2>UVA照射使HaCaT細(xì)胞JNK活性增強(qiáng)，β-胡蘿卜素對(duì)UVA致HaCaT細(xì)胞JNK活性增強(qiáng)具有拮抗作用。 2.4．J/cm<'2>UVA照射使HaCaT細(xì)胞TNF-α及IL-1β基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)、蛋白表達(dá)增多，正常情況下HaCaT不表達(dá)IL-1