IL-10對IL-1β刺激肺成纖維細胞表達ICAM-1作用的研究.pdf

1、目的：本研究利用體外培養(yǎng)大鼠胚肺成纖維細胞，采用RT-PCR、Western blot等檢測方法，測定肺成纖維細胞ICAM-1 mRNA表達水平及NF-κB P65蛋白表達，觀察IL-10對促炎因子(如IL-1β)刺激肺成纖維細胞表達粘附分子的影響，并探討NF-κB信號通路在其中的作用，為肺纖維化的治療提供新的理論依據。
　　方法：采用組織塊法對大鼠胚肺成纖維細胞的培養(yǎng)：將Wister臨產孕鼠摘除眼球放血處死，立即75％酒精消毒皮

2、毛，在超凈工作臺上取出胎鼠，并對胎鼠開胸取出肺組織，在平衡鹽溶液中剔除支氣管、結締組織等，然后將肺組織剪成1mm×1mm×1mm大小的小塊，加入含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，用無菌吸管吹打均勻，均勻涂于培養(yǎng)瓶中。在95％空氣、5％CO2、37℃飽和濕度條件下培養(yǎng)4～6小時，待組織塊牢固貼壁后，適當補充培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，一周左右待細胞鋪滿瓶底后傳代，在傳代過程中去除小組織塊、紅細胞、上皮細胞等，使之成為形態(tài)、結構、生長狀態(tài)一致的肺成纖

3、維細胞，即第5～6代肺成纖維細胞，進行實驗。
　　每次實驗均在指數(shù)生長的細胞中進行，以細胞數(shù)為1×105/ml，接種到預先放置6mm×22mm消毒蓋玻片的6孔板中。在培養(yǎng)箱中孵育至細胞近80％～100％融合時，棄去培養(yǎng)液，換不含胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12小時，待細胞基本同步化于G0期時，將培養(yǎng)的肺成纖維細胞分為三組(每組6復孔)，(1)對照組：單純加入培養(yǎng)液和二甲基亞砜(DMSO)培養(yǎng)肺成纖維細胞6小時；(2)IL-1β干預組：

4、加入IL-1β15ng/ml刺激肺成纖維細胞6小時；(3)IL-10+IL-1β干預組：加入IL-1010ng/ml和IL-1β15ng/ml共同刺激肺成纖維細胞6小時。采用RT-PCR法測定肺成纖維細胞中ICAM-1 mRNA表達水平，Western Blot蛋白免疫印跡法測定肺成纖維細胞中NF-κB P65蛋白的表達水平。
　　結果：
　　1)成功培養(yǎng)Wistar臨產孕鼠原代肺成纖維細胞：本實驗通過應用組織切塊法培養(yǎng)Wi

5、star臨產孕鼠肺成纖維細胞，培養(yǎng)5-10h后在倒置顯微鏡鏡下即觀察到圓形的細胞從組織塊周圍游走出來，經1周左右，這種圓形細胞逐漸變成橢圓、菱形，并成放射狀，足變長，相鄰細胞融合，互相連接，細胞核大而圓，明亮。經2～3次胰酶消化純化后，遺留的組織塊、紅細胞、上皮細胞等逐漸被清除，剩下形態(tài)、結構、生長狀態(tài)一致的肺成纖維細胞(細胞形態(tài)一致，胞體豐滿，胞質均勻，核仁清晰，可見核分裂相，生長狀況良好)，為理想的肺成纖維細胞實驗模型。
　　

6、2)RT-PCR方法測定肺成纖維細胞ICAM-1mRNA表達水平的變化：
　　ICAM-1mRNA在肺成纖維細胞中有一定量的基礎表達，對照組為0。350±0.032；IL-1β干預組ICAM-1mRNA的表達量為0.860±0.017，明顯高于對照組(P＜0.01)；IL-10+IL-1β干預組ICAM-1mRNA的表達量為0。626±0.011，明顯低于IL-1β干預組，明顯高于對照組，均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

7、　　3)Western blot方法測定肺成纖維細胞NF-κBP65蛋白表達水平的變化：
　　NF-κBP65蛋白在肺成纖維細胞中存在基礎表達，對照組為0.608±0.028；IL-1β干預組NF-κB P65蛋白表達為1.214±0.019，明顯高于對照組(P＜0.01)；IL-10+IL-1β干預組NF-κB P65蛋白表達為0.730±0.011，明顯低于IL-1β干預組，明顯高于對照組，均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。<