MGF E肽預處理對CoCl2誘導低氧下MSCs增殖、分化的影響.pdf

1、間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)因其具有良好的自我更新與多向分化潛能，被廣泛用于細胞治療和再生醫(yī)學中?，F(xiàn)有的實驗研究與臨床檢測發(fā)現(xiàn)， MSCs參與調(diào)控了骨修復過程并起到至關重要的作用，與血管生成、免疫調(diào)節(jié)及成骨分化等密切相關。骨再生過程中，MSCs能夠遷移到損傷位點，增殖并開始向軟骨細胞及成骨細胞分化，進一步地分別介導軟骨內(nèi)和膜內(nèi)骨化。通常，MSCs在機體內(nèi)處于一種低氧微環(huán)境中(1％-7%pO2)，

2、甚至在骨缺損修復過程中將會承受更為嚴重的低氧應激。之前的研究已經(jīng)表明，嚴重的低氧條件會顯著地抑制 MSCs的細胞活力、增殖以及成骨分化，這些均是目前階段亟需解決的問題。多種生長因子被證實在MSCs的細胞動力學、增殖以及成骨成骨分化過程中具有良好的調(diào)控作用。其中，力生長因子(mechano growth factor,MGF) E肽（下文中縮寫為MGF）能夠有效地保護細胞或者組織免于低氧損傷。盡管如此，MGF是否能夠調(diào)控嚴重低氧環(huán)境條件下

3、MSCs的增殖和成骨分化仍是未知的。本文使用氯化鈷(CoCl2)模擬嚴重低氧環(huán)境，檢測嚴重低氧環(huán)境下MGF預處理對MSCs的細胞增殖與成骨分化的影響。本文主要內(nèi)容與相關結(jié)果如下：
　　(1)利用CoCl2模擬低氧環(huán)境條件并進行低氧條件優(yōu)化選擇。
　　大量的實驗已經(jīng)證實CoCl2能夠有效模擬低氧微環(huán)境，其原理是鈷離子與亞鐵離子能夠在細胞中發(fā)生置換，并阻止低氧誘導因子?(hypoxia inducible factor1??,

4、HIF-1??的降解，從而間接地通過促進HIF-1?積累模擬低氧。在本實驗中，分別使用0、100、200、500、800和1000μM濃度的CoCl2處理MSCs細胞，24h后分別檢測細胞中HIF-1?表達、細胞活力與細胞存活變化。結(jié)果表明，不同濃度的CoCl2均有效促進HIF-1?表達，并有隨CoCl2濃度增加逐步上升的趨勢，證明成功地建立低氧模型。24h后，MSCs細胞活力分別被0、100、200、500、800、1000μM濃度的

5、CoCl2調(diào)節(jié)到116.85±2.23%、117.89±0.81%、69.03±1.92%、28.46±6.46%與11.55±1.99%。實驗中發(fā)現(xiàn)，當CoCl2濃度超過500μM時，細胞開始出現(xiàn)明顯的死亡現(xiàn)象。因此，本實驗選擇500μM濃度CoCl2作為隨后實驗的最優(yōu)條件（對MSCs有害但非致死）。當選擇500μM濃度CoCl2處理MSCs1、2、4、8、12及24h，MSCs細胞活力分別下降到92.83±2.58%、93.35±3

6、.42%、92.55±5.35%、90.85±4.13%、91.25±5.63%以及69.23±2.20%。因此，500μM濃度CoCl2培養(yǎng)24h后能夠顯著性地抑制MSCs細胞活力但不足以誘發(fā)細胞凋亡現(xiàn)象，能夠更適宜地模擬嚴重的低氧環(huán)境。
　　(2)嚴重低氧條件下MGF對MSCs增殖、凋亡、形態(tài)、粘附及遷移的影響。
　　本文實驗結(jié)果顯示，不同濃度的CoCl2(0,100,200,500,800,1000μM)處理MSCs2

7、4h后，快速地抑制了MGF mRNA表達，結(jié)果暗示了MGF參與低氧微環(huán)境對 MSCs細胞生理生化調(diào)控的可能性。通過檢測MGF預處理后低氧對MSCs細胞形態(tài)、增殖、凋亡、粘附與遷移的結(jié)果顯示，嚴重低氧條件下MSCs細胞面積收縮，圓度降低。同時，細胞貼壁實驗與transwell實驗結(jié)果顯示，細胞粘附與遷移能力被顯著地抑制，細胞動力學能力明顯不足。幸運的是，MGF預處理改善了嚴重低氧條件下MSCs細胞活力，5、10、20、50及100ng/m

8、l濃度的MGF分別上調(diào)了嚴重低氧條件下MSCs的細胞活力53.07%、55.95%、71.23%、61.09%及58.90%，且與正常組相比無明顯差異。不僅如此，MGF預處理還降低了嚴重低氧條件下MSCs中HIF-1?的表達以及核轉(zhuǎn)移，細胞圓度及細胞面積均得到不同程度的恢復，并促進了細胞粘附與遷移能力，同時對MSCs凋亡無任何影響，即不存在細胞毒性作用。
　　(3)MGF在嚴重低氧條件下對MSCs成骨分化的影響。
　　堿性磷

9、酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性及茜素紅S染色分析用以檢測MGF對嚴重低氧條件下MSCs成骨分化的影響。參考之前的實驗可知，ALP活性不僅能夠作為細胞多能性的指標，同時也是干細胞早期成骨分化的重要參考，而茜素紅染色能夠直觀地觀察到細胞中鈣沉積現(xiàn)象。分析上述實驗結(jié)果顯示，嚴重的低氧顯著抑制了MSCs成骨分化，ALP活性與MSCs中鈣沉積均被明顯地抑制。但MGF預處理組與單獨CoCl2處理組相比成骨分化能力顯著恢

10、復，ALP活性及鈣沉積均得到明顯提升。分別于成骨分化第0、7及14天時檢測相關的標記基因ALP、runt相關轉(zhuǎn)錄因子2(runt related transcription factor2,Runx2)及骨鈣素(bone gamma-carboxyglutamic-acid-containing proteins,BGP)的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在嚴重低氧條件下成骨分化相關的基因表達在不同時間均受到抑制，但經(jīng)MGF預處理后在第7與14天時得到有

11、效恢復。進一步地，我們檢測了MGF預處理對輕度低氧100μM濃度CoCl2條件下MSCs成骨分化的影響，結(jié)果趨勢與500μM濃度CoCl2條件下一致，圖片結(jié)果顯示更為明顯。有趣的是，本文研究發(fā)現(xiàn)，單獨的MGF處理同樣促進了MSCs的成骨分化能力，與之前的研究結(jié)論并不一致。分析發(fā)現(xiàn)本文實驗與之前研究中MGF處理細胞方式存在差異，因此，本文分別選擇MGF持續(xù)處理與分化培養(yǎng)前一次性預處理MSCs，并檢測MSCs的成骨分化現(xiàn)象。結(jié)果顯示，MGF

12、一次性預處理提高了MSCs的成骨分化能力，而持續(xù)性的MGF處理反而抑制了MSCs的成骨分化能力，表現(xiàn)出MGF處理方式的依賴性。
　　綜上所述，本文證實嚴重的低氧微環(huán)境會顯著性地抑制了MSCs的細胞活力，改變了細胞形態(tài)，并降低了細胞的增殖、運動及成骨分化能力，嚴重阻遏了骨修復進程。通過MGF的預處理后，MSCs的細胞活力得到有效恢復，細胞形態(tài)、增殖、遷移與成骨分化能力均顯著性地提升。除此之外，MGF預處理有效地減弱了嚴重低氧對MSC