microRNA在PC12細(xì)胞CoCl-,2-誘導(dǎo)分化過(guò)程中的表達(dá)差異分析.pdf

1、MicroRNAs是一類長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸、進(jìn)化上高度保守的內(nèi)源性非編碼RNA，通過(guò)轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因發(fā)揮作用。許多miRNAs(如miR-124，miR-9a)在神經(jīng)細(xì)胞分化與增殖中起到了非常重要的作用。大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12細(xì)胞)具有神經(jīng)嵴源性，使用COCl2誘導(dǎo)48小時(shí)后，可以產(chǎn)生神經(jīng)突觸樣突起，因此PC12細(xì)胞常用作神經(jīng)細(xì)胞分化的模型。本論文探討了microRNA在PCl2細(xì)胞COCl2誘導(dǎo)分化過(guò)程中的作用。 首先

2、，我們使用CoCl2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化，建立了缺氧.神經(jīng)分化的細(xì)胞模型。用150uM COCl2處理PC12細(xì)胞24h及48h后，缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α及HIF-1α下游基因VEGF表達(dá)升高，說(shuō)明缺氧處理有效，并且在光鏡下可見(jiàn)PC12細(xì)胞出現(xiàn)類神經(jīng)元的分化。 然后，我們應(yīng)用microarray芯片技術(shù)，檢測(cè)PC12細(xì)胞COCl2誘導(dǎo)分化過(guò)程中348種大鼠miRNA的表達(dá)差異，結(jié)果提示COCl2誘導(dǎo)24h后，22個(gè)miRNA表

3、達(dá)上升，21個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)；COCl2誘導(dǎo)48h后，45個(gè)miRNA表達(dá)上升，30個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)。我們選定2個(gè)代表性的microRNA：miR27b(表達(dá)顯著下調(diào))和miR325-3p(表達(dá)顯著上調(diào))作為研究對(duì)象。并應(yīng)用RT，Real Time PCR試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證miRNA27b和miR325-3p在PC12細(xì)胞COCl2誘導(dǎo)分化過(guò)程中的表達(dá)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR27b表達(dá)水平持續(xù)下降，miR325-3p表達(dá)水平持續(xù)上升，與芯片

4、結(jié)果一致。 在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用脂質(zhì)體向PC12細(xì)胞中轉(zhuǎn)染合成的成熟miR27b，在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)， Real Time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示轉(zhuǎn)染后PC12細(xì)胞中miR27b含量明顯高于未轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞中miR27b的水平(15:1)，但轉(zhuǎn)染miR27b對(duì)PC12細(xì)胞CoCl2誘導(dǎo)分化過(guò)程并無(wú)明顯影響。同時(shí)，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法向CoCl2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入外源性miR325-3p反義序列，我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)miR325-3p反義序