脅迫誘導(dǎo)棉花microRNA的差異表達(dá)分析.pdf

1、MicroRNA(miRNA)是一類(lèi)內(nèi)源性的、非編碼單鏈小RNA。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 作為基因表達(dá)中的一類(lèi)負(fù)調(diào)控子，不僅在植物新陳代謝、器官發(fā)育及組織分化中起重要的作用，而且可以響應(yīng)植物的生物和非生物逆境脅迫，在植物感受逆境脅迫而做出適應(yīng)性調(diào)整的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。因此，對(duì)脅迫誘導(dǎo)miRNA進(jìn)行研究，有助于探明植物逆境適應(yīng)反應(yīng)的“成因機(jī)理”以及miRNA所介導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為提高轉(zhuǎn)基因植物抵抗脅迫的能力提供新的途徑。<

2、br>　　 本研究選用高鹽和黃萎病兩種代表性的環(huán)境脅迫（前者是非生物脅迫，后者是生物脅迫）對(duì)棉花進(jìn)行脅迫處理，利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合的方法，鑒定了棉花中的miRNA，分析了脅迫誘導(dǎo)條件下棉花miRNA的差異表達(dá)情況，初步探討了差異表達(dá)miRNA 在抗逆反應(yīng)中所起的作用，為闡明棉花耐鹽和抗黃萎病的調(diào)控途徑提供參考。本研究獲得的主要結(jié)果如下：
　　 1.在miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)(Release 10.1)中篩選出保守的植

3、物miRNA家族，并以它們的序列作為“種子序列”應(yīng)用于同源搜索miRNA方法當(dāng)中，在EST、GSS和Core-Nucleotide數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索預(yù)測(cè)miRNA，從而改進(jìn)miRNA 計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)方法。
　　 2.利用改進(jìn)的miRNA 計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)方法預(yù)測(cè)了棉花等作物中的miRNA。在預(yù)測(cè)的得到的棉花miRNA中，有2個(gè)來(lái)自于GSS序列,3個(gè)來(lái)自于Core-Nucleotide序列，其余的16個(gè)來(lái)自于EST序列。
　　 3.利用m

4、iRNA 芯片驗(yàn)證以上預(yù)測(cè)得到的棉花miRNA，芯片雜交結(jié)果顯示其中10個(gè)屬于可檢測(cè)miRNA。利用熒光定量PCR 檢測(cè)了miRNA 在高鹽脅迫條件下，兩種棉花品系（耐鹽品系山農(nóng)91-11和鹽敏感品系魯棉6號(hào)）中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：高鹽脅迫條件下，miR156a、miR156d、miR156e和miR169在耐鹽品系山農(nóng)91-11中表達(dá)量下調(diào)，miR167a和miR399a表達(dá)量上調(diào)，而miR159在鹽敏感品系魯棉6號(hào)中表達(dá)量下調(diào)。<

5、br>　　 4.利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)得到棉花miRNA的靶基因共23個(gè)，利用熒光定量PCR 檢測(cè)了5個(gè)靶基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：高鹽脅迫條件下，SPL3，RNA helicase和HAP2 在耐鹽品系山農(nóng)91-11中表達(dá)量上調(diào)，而ARF8和Ghi.6739表達(dá)量下調(diào)。
　　 5.以陸地棉-冀棉11（易感黃萎?。┖秃u棉-海7124（抗黃萎?。檠芯坎牧?，分別建立了正常生長(zhǎng)和黃萎病菌侵染條件下的四個(gè)小RNA 庫(kù)，然后利用高通量S

6、olexa測(cè)序共獲得68 970 173條小RNA序列；結(jié)合生物信息學(xué)分析得到215個(gè)棉花miRNA；不同樣本間小RNA種類(lèi)及數(shù)量差異顯著，平均約有40％的Unique sRNA 為樣本特有sRNA。
　　 6.將四個(gè)小RNA庫(kù)中miRNA數(shù)量歸一化，比較miRNA表達(dá)量的差異。結(jié)果顯示：在冀棉11中,38個(gè)miRNA在黃萎病菌侵染條件下表達(dá)量下調(diào)，15個(gè)miRNA表達(dá)量上調(diào)；在海7124中,24個(gè)miRNA在黃萎病菌侵染條件下