具核梭桿菌通過激活Wnt信號通路促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展.pdf

1、目的：為了探討具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum）通過上調(diào)TLR4的表達(dá)，對PAK1、PAK1(Thr423)、beta-catenin、beta-catenin(Thr675)、Cyclin-D1、C-myc等基因蛋白水平表達(dá)的影響，由此推測具核梭桿菌在結(jié)直腸癌變過程中所扮演的角色。
　　方法：將結(jié)直腸癌（CRC），無蒂鋸齒狀腺瘤（SSA），增生性息肉（HP），傳統(tǒng)腺瘤（TA），結(jié)直腸癌相應(yīng)淋巴結(jié)標(biāo)本的石

2、蠟切片用免疫組化方法檢測各組織中PAK1和TLR4的陽性表達(dá)情況，原位雜交方法檢測不同組織中具核梭桿菌的存在及定位情況；提取由臨床收集的結(jié)直腸癌（CRC）標(biāo)本中分離培養(yǎng)所得的具核梭桿菌LPS，將其作用于結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480，同時(shí)用商品化LPS以相同條件作用SW480細(xì)胞，利用Western blot對比分析具核梭桿菌對細(xì)胞內(nèi)TLR4、PAK1、PAK1(Thr423)、beta-catenin、beta-catenin(Thr675

3、)、Cyclin-D1、C-myc等基因蛋白水平表達(dá)的影響。為進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞內(nèi)蛋白之間的相互影響，利用TLR4特異性拮抗劑TAK-242和PAK1特異性拮抗劑IPA-3作用SW480細(xì)胞，利用Western blot觀察當(dāng)細(xì)胞內(nèi)TLR4、PAK1作用被拮抗后，下游相應(yīng)蛋白的表達(dá)變化。利用細(xì)胞免疫熒光，觀察 LPS、TAK-242、IPA-3作用細(xì)胞后，beta-catenin(Thr675)在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及定位的變化。
　　結(jié)果：

4、
　?。?）免疫組化結(jié)果顯示：PAK1、TLR4、beta-catenin在 CRC組織中的表達(dá)明顯高于其他組織類型，且 CRC組織中科觀察到beta-catenin明顯的核聚集現(xiàn)象；
　?。?）熒光原位雜交結(jié)果顯示：近端CRCs中Fn陽性率為89.6％，近端HPs中Fn陽性率為65.7%，SSAs中Fn陽性率為78.8%，近端TAs中Fn陽性率為28.9%，遠(yuǎn)端CRCs中Fn陽性率為42.2%，遠(yuǎn)端HPs中Fn陽性率為47

5、.5%,遠(yuǎn)端TAs中Fn陽性率為24.4%，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中Fn陽性率為100%，無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中Fn陽性率為40%；Fn普遍存在于近端SP中，TA中少見，近端CRCs和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中Fn較遠(yuǎn)端CRCs和無轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中Fn陽性率高；
　?。?）Western blot結(jié)果顯示，F(xiàn)n LPS和商品化LPS對SW480細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)有類似作用。隨著兩種LPS作用時(shí)間延長（0，2，6，12，24h），TLR4、PAK1(Thr423)、beta

6、-catenin(Thr675)、Cyclin-D1、C-myc的表達(dá)呈遞增趨勢，此趨勢在Fn LPS作用細(xì)胞中更為明顯；以TAK-242作用SW480細(xì)胞，隨著作用時(shí)間延長（0，2，6，12，24h），PAK1(Thr423)、beta-catenin(Thr675)、Cyclin-D1的表達(dá)呈遞減趨勢；以IPA-3作用于SW480細(xì)胞，隨著作用時(shí)間延長（0，2，6，12，24h），PAK1(Thr423)、beta-catenin(

7、Thr675)、Cyclin-D1的表達(dá)呈遞減趨勢，TLR4呈遞增趨勢。Fn通過其LPS增加TLR4的表達(dá)，進(jìn)而提高PAK1 S423、beta-catenin S675的磷酸化程度，以此激活Wnt信號通路，促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。
　?。?）Fn LPS、TAK-242、IPA-3組合作用于SW480細(xì)胞，利用細(xì)胞免疫熒光可觀察到，TAK-242、IPA-3預(yù)處理細(xì)胞，即使后來加入LPS，其beta-catenin(Thr675