具核梭桿菌促進(jìn)大腸癌發(fā)生的相關(guān)性研究.pdf

1、目的:
　　目前，大腸癌(Colorectal Cancer, CRC)是常見(jiàn)的惡性腫瘤性疾病之一，但其具體病因及發(fā)病機(jī)制仍不明確。有關(guān)報(bào)道指出多種因素如遺傳背景、環(huán)境和飲食等影響了大腸癌的發(fā)病過(guò)程，其中腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變被認(rèn)為與大腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的增加有著密切聯(lián)系。有研究指出在結(jié)直腸腫瘤組織中存在大量梭桿菌屬的DNA，并經(jīng)過(guò)腫瘤/正常結(jié)腸組織DNA測(cè)序后得到證實(shí)。其中具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum，F(xiàn)n)

2、明顯增加，并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。本研究將通過(guò)C57小鼠在體構(gòu)建原位大腸癌的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，探討Fn影響腸道腫瘤的發(fā)生及對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響。
　　方法:
　　(1) Fn黏附和侵入結(jié)腸癌上皮細(xì)胞的測(cè)定。將Fn和結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116細(xì)胞共培養(yǎng)。利用HE染色進(jìn)行細(xì)菌黏附、侵入細(xì)胞?；蛐酒磉_(dá)篩選差異基因。
　　(2)原位大腸癌腫瘤動(dòng)物模型的建立。將8-10周齡C57小鼠隨機(jī)分組，經(jīng)1周的環(huán)境適應(yīng)期后，根據(jù)組別不同分

3、別給予腹腔注射氧化偶氮甲烷(azoxymethane，AOM)或生理鹽水，注射后7天，給予Fn菌液或生理鹽水灌胃，一周后再給予第二個(gè)循環(huán)。于第81天處死小鼠，將全結(jié)腸標(biāo)本取材后剖開(kāi)記錄腫瘤的形成情況。利用HE染色進(jìn)行組織學(xué)觀察，鑒別腫瘤病理性質(zhì);酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8)、環(huán)氧化酶2(COX-2)、腫瘤壞死因子(TNF-α)等，分析Fn對(duì)炎癥因子的影響，從分子水平探求相關(guān)作用機(jī)制;

4、>　　(3)大腸癌動(dòng)物模型腸道中菌群結(jié)構(gòu)改變的檢測(cè)。利用QIAamp DNAStool試劑盒對(duì)腸腔糞便標(biāo)本進(jìn)行基因組DNA抽提;利用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA，對(duì)各標(biāo)本基因組DNA含量進(jìn)行鑒定;利用ABI GeneAmp對(duì)抽提的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物、繼而熒光定量;利用Roche GS FLX454對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的16S rRNA V3可變區(qū)進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，通過(guò)SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)將

5、所測(cè)序列進(jìn)行生物信息學(xué)比對(duì)，并經(jīng)Good's覆蓋率、Shannon指數(shù)、PCA、LEfSe判別分析等多種途徑對(duì)各組微生物種類進(jìn)行分類學(xué)和多樣性的比較，以期發(fā)現(xiàn)腸腔菌群結(jié)構(gòu)的差異性改變;
　　(4) Fn干預(yù)下大腸癌動(dòng)物模型腫瘤組織中菌群結(jié)構(gòu)改變的檢測(cè)及與腫瘤發(fā)生的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將收集的腫瘤組織標(biāo)本利用QIAamp DNA Mini試劑盒進(jìn)行基因組DNA抽提，后續(xù)基因組DNA鑒定、PCR擴(kuò)增、熒光定量、16S rRNA V

6、3可變區(qū)測(cè)序和生物信息學(xué)分析均如上所述;分組比較Fn干預(yù)與對(duì)照組組織中菌群結(jié)構(gòu)的差異及其與腫瘤發(fā)生情況的關(guān)系;
　　結(jié)果:
　　(1) Fn能黏附和侵入結(jié)腸上皮細(xì)胞，在短時(shí)間內(nèi)能保持一定的黏附附和侵入量，在細(xì)胞內(nèi)保持一定的活力?；蛐酒Y選出差異基因，其中BIRC3和NF-kB表達(dá)明顯升高。
　　(2)實(shí)驗(yàn)成功建立了原位大腸癌的腫瘤動(dòng)物模型。發(fā)現(xiàn)Fn干預(yù)下的腫瘤發(fā)生情況明顯高于對(duì)照組;發(fā)現(xiàn)Fn組小鼠血清中的IL-6、I

7、L-8、COX-2、TNF-α等細(xì)胞因子水平明顯高于SD組，提示炎癥介導(dǎo)了Fn促進(jìn)大腸癌進(jìn)展的過(guò)程;Fn組腫瘤組織PCNA、BIRC3和NF-kB水平明顯高于對(duì)照組
　　(3)Fn干預(yù)后的焦磷酸測(cè)序結(jié)果顯示Fn能夠?qū)е履c道菌群結(jié)構(gòu)失衡，增加大腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。主成份分析(PCA)發(fā)現(xiàn)不同組的腸道中菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異。發(fā)現(xiàn)腫瘤組中硬壁菌門(mén)(Firmicutes)豐度顯著增加，而擬桿菌門(mén)(B acteroidetes)豐度明顯下降;對(duì)

8、照組中未檢測(cè)到梭狀桿菌門(mén)(Fusobacteria)，蛋白菌門(mén)(Proteobacteria)在對(duì)照組中豐度較高，但兩組間無(wú)顯著性差異;在屬水平上，發(fā)現(xiàn)腫瘤組中產(chǎn)丁酸鹽菌Roseburia屬、Eubacerium屬和益生菌Ruminococcus屬明顯減少，而潛在致病菌Fusobacterium屬則顯著增加。腫瘤組中擬桿菌屬（Bacteroides）豐度高于對(duì)照組(2.12％ vs.0.31％，p＜0.001)，而對(duì)照組中Lactoba