核基質(zhì)結(jié)合因子SAFB在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其分子機制.pdf

1、研究背景和目的：
　　 結(jié)直腸癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,居胃腸道腫瘤的第二位。因此探討與結(jié)直腸癌致病相關(guān)的因素,闡明結(jié)直腸癌發(fā)病機制,尋找預(yù)防和治療的有效途徑,是當(dāng)前研究的重要方向。
　　 核基質(zhì)結(jié)合結(jié)合因子(Scaffold attachment factor B,SAFB)是一種多功能蛋白,位于19號染色體19p13.3。它屬于一個核蛋白家族,定位于核基質(zhì)中,通過與核基質(zhì)中DNA和RNA相互作用,影響RNA轉(zhuǎn)錄

2、后加工,參與發(fā)育、組織重建、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)以及細(xì)胞增殖和凋亡過程。目前有研究表明SAFB與乳腺癌發(fā)生和預(yù)后關(guān)系密切,盡管SAFB在乳腺癌中的作用較明確,但在其它腫瘤中未見報道,其在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的作用及分子機制亦尚未闡明。因此,本研究重點探討SAFB基因在結(jié)直腸癌增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中的可能作用及分子機制,旨在闡明SAFB在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的主要生物學(xué)功能,為結(jié)直腸癌的早期診斷、干預(yù)和治療及其預(yù)后奠定理論基礎(chǔ)。
　　

3、 方法：
　　 1.結(jié)直腸癌組織及結(jié)直腸癌細(xì)胞株中SAFB的表達(dá)及臨床意義
　　 運用RT-PCR、Real-time PCR及Western blot方法檢測SAFB基因在8種結(jié)直腸癌細(xì)胞株及28對配對結(jié)直腸癌和正常組織中的mRNA和蛋白表達(dá)；應(yīng)用免疫組化S-P法,檢測283例結(jié)直腸癌組織和配對的114例正常結(jié)直腸組織以及120例結(jié)直腸癌區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌蛋白的表達(dá)。
　　 2.SAFB過表達(dá)載體構(gòu)建及對結(jié)直腸癌

4、細(xì)胞生物學(xué)特性的影響
　　 運用RT-PCR法擴(kuò)增目的基因SAFB,與空載體pcDNA3.1(一)連接后,在8種結(jié)直腸癌細(xì)胞株中低表達(dá)的細(xì)胞株SW480中導(dǎo)入pcDNA3.1(一)/SAFB,Real-timePCR及Western blot鑒定轉(zhuǎn)染后SAFB基因在細(xì)胞中的表達(dá)；觀察SAFB基因轉(zhuǎn)染前后,細(xì)胞增殖的變化。
　　 3.SAFB干擾載體的構(gòu)建及表達(dá)沉默對結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響
　　 設(shè)計SAFB

5、干擾片段,將人SAFB基因RNA干擾雙鏈DNA片段重組到逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒pSUPER Retro中,構(gòu)建攜帶人SAFB基因RNA干擾的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSUPER/shRNA-SAFB,經(jīng)293FT病毒包裝細(xì)胞后,產(chǎn)生重組逆轉(zhuǎn)錄病毒,感染結(jié)直腸癌細(xì)胞株,經(jīng)puromycin篩選穩(wěn)定的細(xì)胞克隆,實時熒光定量PCR和Western blot法檢測細(xì)胞中SAFB基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白的表達(dá)水平。
　　 用含SAFB的特異性干擾片段的

6、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染結(jié)直腸癌細(xì)胞,用含空載體的病毒做對照。用G418篩選抗性克隆,挑取抗性單克隆,熒光定量PCR和Westernblot鑒定干擾后SAFB基因在細(xì)胞中的表達(dá)；利用MTT法、平板克隆形成實驗檢測SAFB對細(xì)胞體外增殖的影響。
　　 4.SAFB表達(dá)異常引起結(jié)直腸細(xì)胞生物學(xué)功能異常的分子機制
　　 通過Real-time PCR及Western blot方法檢測結(jié)直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(一)/SAFB及pS

7、UPER/shRNA-SAFB后,E-Cadherin、Slug、Snail、MTA、α-cantenin、γ-cantenin、β-cantenin、AKT、P38 MAPK、GSK、p-AKT、p-P38 MAPK、p-GSK等的mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.結(jié)直腸癌組織中SAFB蛋白的表達(dá)
　　 應(yīng)用RT-PCR檢測8種結(jié)直腸癌細(xì)胞株SAFB基因的表達(dá),結(jié)果表明SAFB基因在SW6

8、20細(xì)胞中表達(dá)較高,在DLD-1、SW480-M5、LS174T和HT29中度表達(dá),在SW480、HCT116、colo205表達(dá)較低。應(yīng)用RT-PCR、Real-time PCR及Western blot檢測28對結(jié)直腸癌配對組織SAFB在mRNA和蛋白水平的表達(dá),結(jié)果表明28對結(jié)直腸癌配對組織中SAFB基因在腫瘤組織表達(dá)較高,在正常結(jié)直腸組織表達(dá)較低或不表達(dá),而其表達(dá)水平高低與結(jié)直腸癌浸潤程度、分化程度及轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性。
　

9、　 免疫組化結(jié)果顯示SAFB在正常結(jié)直腸黏膜、癌、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌四種類型的組織中表達(dá)明顯不同,差異具有顯著性(x2=271.214,P<0.01)。兩兩比較發(fā)現(xiàn),在正常黏膜組織和腫瘤組織中,SAFB蛋白的表達(dá)前者顯著低于后者(Z=-4.608,P=0.000),發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移癌組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織SAFB表達(dá)與配對的結(jié)直腸原發(fā)癌組織無顯著性差異(Z=-0.156,P=0.876;Z=-0.466,P=0.642)。本研究結(jié)果

10、提示,SAFB蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌發(fā)病及腫瘤細(xì)胞增殖高度相關(guān),即SAFB表達(dá)弱或陰性者結(jié)直腸發(fā)生率低,表達(dá)強者發(fā)生率高,而與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性。
　　 2.過表達(dá)SAFB真核表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染SAFB過表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響
　　 設(shè)計人SAFB特異性引物,提取人正常結(jié)直腸上皮組織總RNA,應(yīng)用RT-PCR方法提取人SAFB cDNA,通過雙酶切,將SAFB克隆至pcDNA3.1(一)質(zhì)粒,經(jīng)雙酶切及

11、測序鑒定,確定構(gòu)建人SAFB基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(一)/SAFB,轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞,用Western Blot技術(shù)檢測目的蛋白的表達(dá)。
　　 通過MTT法,我們檢測了SAFB對結(jié)直腸癌細(xì)胞體外增殖能力的影響,與pcDNA3.1(一)/vector細(xì)胞相比,pcDNA3.1(一)/SAFB細(xì)胞的增殖能力增強,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=71.944,P<0.01)。
　　 3.通過RNAi技術(shù)建立SAFB基因穩(wěn)

12、定沉默的結(jié)直腸癌細(xì)胞株及對結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響
　　 構(gòu)建了2個SAFB的逆轉(zhuǎn)錄病毒干擾載體pSUPER/shRNA-SAFB1、pSUPER/shRNA-SAFB2(簡稱S1和S2)及空載體病毒pSUPER retro neo(簡稱PRS),感染HCT116、SW480及SW620細(xì)胞,篩選出G418抗性單克隆,熒光定量PCR和Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)含兩種片段干擾載體的干擾效率均較高,以S2為甚,且對SW62

13、0細(xì)胞的干擾效率最好,命名為SW620/pSUPER/shRNA-SAFB。
　　 MTT法觀察SAFB基因表達(dá)沉默后體外細(xì)胞的增殖情況,與SW620/pSUPER細(xì)胞相比,SW620/pSUPER/shRNA-SAFB細(xì)胞的增殖速度減慢顯著,并且呈時間依賴關(guān)系(F=3.361,P<0.01)。平板克隆形成實驗顯示SW620/pSUPER/shRNA-SAFB細(xì)胞的活力顯著下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=267.579,P=0.0

14、00)。這些結(jié)果均說明SAFB表達(dá)水平減低后,結(jié)直腸癌細(xì)胞體外生長被顯著抑制。
　　 4.SAFB表達(dá)異常引起結(jié)直腸細(xì)胞生物學(xué)功能異常的分子機制
　　 1)SAFB對相關(guān)鈣粘附蛋白的影響及其與上皮間葉轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)發(fā)生的關(guān)系
　　 Western blot顯示,SAFB可以誘導(dǎo)鈣粘附蛋白(E-cadherin)表達(dá)缺失。SW480細(xì)胞自身E-ca

15、dherin的表達(dá)缺如或者檢測不到,但當(dāng)SAFB表達(dá)水平被抑制時,SW480細(xì)胞E-cadherin則恢復(fù)表達(dá)。Slug、Snail、MTA是參與上皮間葉轉(zhuǎn)化的重要轉(zhuǎn)錄因子,Western blot結(jié)果顯示,在SAFB敲低的兩個克隆中,Slug、Snail、MTA的表達(dá)受到抑制；Snail、MTA和Slug與E-cadherin的表達(dá)成負(fù)相關(guān)關(guān)系,這與SAFB對二者的調(diào)節(jié)也是一致的。
　　 2)SAFB對Catenin家族成員的

16、影響
　　 Western Blot檢測表明,抑制SAFB基因表達(dá)對catenin家族的影響不明顯。
　　 3)GSK-3 β磷酸化是SAFB調(diào)節(jié)鈣粘附蛋白相關(guān)信號通路的重要方式
　　 我們觀察到,抑制SAFB表達(dá)使GSK-3 β磷酸化明顯受抑制,p-GSK-3 β表達(dá)下調(diào),GSK-3 β表達(dá)無明顯改變。
　　 4)SAFB對P38 MAPK相關(guān)信號通路的影響
　　 我們觀察到,SAFB敲低P38

17、 MAPK磷酸化明顯受抑制,p-P38 MAPK表達(dá)下調(diào),P38 MAPK表達(dá)無明顯改變。
　　 5)SAFB對AKT相關(guān)信號通路的影響
　　 Western Blot檢測表明,SAFB基因沉默對AKT信號通路的影響不明顯。
　　 結(jié)論：
　　 1、SAFB基因與結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖密切相關(guān),提示SAFB基因可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生及發(fā)展；
　　 2、SAFB可能參與+它在結(jié)直腸癌中的作用,證實SAFB

18、通過誘導(dǎo)E-cadherin表達(dá)下調(diào)促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞上皮間葉轉(zhuǎn)化；
　　 3、SAFB可能通過激活MAPK信號通路,磷酸化GSK-3 β,激活下游的細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)基因(CyclinDl等),從而促進(jìn)細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移；調(diào)節(jié)EMT分子標(biāo)志物的表達(dá),可能促進(jìn)結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移。
　　 本研究的創(chuàng)新之處:
　　 1、構(gòu)建了SAFB過表達(dá)和敲低的相關(guān)載體,建立了SAFB過表達(dá)和敲低的結(jié)直腸癌細(xì)胞克?。?br>　　 2、發(fā)現(xiàn)SAF