二甲雙胍對(duì)2型糖尿病患者腸道菌群及慢性炎癥狀態(tài)的影響.pdf

1、背景與目的：
　　慢性代謝性疾病(chronicmetabolicdiseases)是一組以肥胖、高血壓、糖尿病、血脂異常、冠心病、腦卒中等疾病為主的代謝性臨床癥候群。代謝性疾病已成為嚴(yán)重影響人類(lèi)健康的一組疾病，在遺傳因素較為固定的背景下，環(huán)境因素顯得尤為重。隨著微生物技術(shù)的發(fā)展，分子微生物學(xué)較多的運(yùn)用于腸道菌群的研究。在人體腸道內(nèi)，結(jié)腸的微生物分布最密集，不同物種，腸腔分布的細(xì)菌群落種類(lèi)及數(shù)量不同，由于技術(shù)和倫理學(xué)限制，只能通過(guò)

2、對(duì)人體或動(dòng)物模型糞便中提取的菌群研究分析，但糞便菌群是否可以反映腸道內(nèi)主要菌群不得而知。許多研究將腸道微生物詮釋為環(huán)境因素影響宿主營(yíng)養(yǎng)、代謝及免疫功能，對(duì)人體健康十分重要。目前，體內(nèi)腸道菌群失調(diào)和低活度慢性炎癥狀態(tài)發(fā)揮的重要作用在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)展中逐漸被關(guān)注。二甲雙胍作為2型糖尿病患者的一線(xiàn)用藥，其治療效果隨英國(guó)(UKPDS)結(jié)果公布得到充分肯定。關(guān)于二甲雙胍對(duì)2型糖尿病患者腸道菌群的影響作用和機(jī)制鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在應(yīng)用ERIC

3、（enterobacte rialrepet itiveintergenic consensus，腸道細(xì)菌基因間重復(fù)序列）-PCR技術(shù)建立各組腸道細(xì)菌DNA指紋圖譜，初步探討服用二甲雙胍后是否可以糾正2型糖尿病患者腸道菌群失調(diào)、改變其慢性炎癥狀態(tài)及代謝紊亂，為其降糖外收益提供依據(jù)。
　　對(duì)象與方法：
　　1.1.對(duì)象
　　10例2013年2月至2013年6月于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科住院的2型糖尿病患者，年齡38～

4、45歲，糖尿病病程0.3-6年。入選標(biāo)準(zhǔn):符合1999年世界衛(wèi)生組織(WHO)的T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)。
　　1.2.標(biāo)本收集
　　實(shí)驗(yàn)組給予（二甲雙胍片0.85gtid），規(guī)律應(yīng)用2周，收集用藥前、后患者新鮮糞便，密封于無(wú)菌厭氧袋;并抽取用藥前后外周血，于4000rpm離心10min，取上清，所有標(biāo)本于半小時(shí)內(nèi)置于-80°冰箱內(nèi)保存。同時(shí)觀察服藥前后血糖（空腹、三餐后）、血脂、炎性因子（血清中C反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞介素6、脂多糖）變

5、化。收集10例健康人新鮮糞便及外周血作為對(duì)照。
　　1.3.實(shí)驗(yàn)試劑及儀器
　　腸道菌群DNA基因組提取試劑盒;瓊脂糖、無(wú)菌PCR小管;DNAmarker、DreamTaqGreenPCRMasterMix、Green-DNADye核苷酸膠體染料、引物;BiometraPCR;電泳儀;紫外凝膠成像系統(tǒng);ELISA試劑盒;血糖儀;單道移液器;DNA濃度測(cè)定儀;高速臺(tái)式離心機(jī)等。
　　1.4.實(shí)驗(yàn)步驟
　　1)腸道菌

6、群總DNA提取將糞便標(biāo)本置于冰上解凍，用生理鹽水洗滌，4000rpm離心1分鐘取沉渣300g于滅菌EP管內(nèi)，使用腸道菌群基因組DNA試劑盒，并按說(shuō)明書(shū)步驟提取DNA。吸取2ulDNA樣本用濃度議測(cè)定濃度。2）PCR擴(kuò)增應(yīng)用ERIC-PCR指紋圖譜分析技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，特異性引物序列ERIC1(5'-ATGAAGCTCCTGGGGAATCCA-3'),ERIC2(5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGATGCG-3')。PCR小管加入反應(yīng)

7、體系25μl:DreamTaqGreenPCRMasterMix12.5μl，ERIC10.5μl，ERIC2μl，water5.5μl，DNA模板量6μl(約80ng)。3)電泳成像產(chǎn)物電泳后在凝膠成像分析系統(tǒng)內(nèi)觀測(cè)電泳條帶并拍照。4)指紋圖譜分析。5）炎性因子的檢驗(yàn)將血清標(biāo)本置冰上解凍，應(yīng)用ELISA試劑盒測(cè)定血清炎癥因子水平。6）其他監(jiān)測(cè)空腹及三餐前、餐后2h末梢血糖，于本院檢驗(yàn)科行生化指標(biāo)測(cè)定。
　　1.5.統(tǒng)計(jì)方法

8、>　　應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理軟件分析，連續(xù)型變量用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((X)±S)表示，兩樣本定量資料的比較應(yīng)用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.用藥后空腹血糖、餐后2h血糖、血總膽固醇(T-CHO)、血清C反應(yīng)蛋白(CRP)、脂多糖(LPS)、白細(xì)胞介素-6(LI-6)水平均較用藥前下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);血甘油三酯(TG)、低密度脂蛋

9、白(LDL)水平較前下降，血高密度脂蛋白(HDL)水平較前升高，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;
　　2.ERIC-PCR指紋分析圖譜顯示健康人腸道菌群的DNA條帶數(shù)目明顯多于T2DM患者，且較亮主條帶位置不同，個(gè)體DNA較亮主條帶呈散在分布，成多樣性分布;T2DM患者腸菌指紋圖譜條帶表現(xiàn)單一，且較量主條帶位置與正常人不同;服用二甲雙胍后T2DM患者腸道菌群的DNA條帶數(shù)目增多，且較亮條帶位置改變，與健康人相似。
　　

10、結(jié)論：
　　1.應(yīng)用二甲雙胍治療2周后，T2DM患者血清中C反應(yīng)蛋白、TNF-a、IL-6、LPS水平均較治療前明顯下降，表明二甲雙胍有助于降低炎癥因子水平、改善患者慢性炎癥狀態(tài)，有利于改善血糖、血脂水平，同時(shí)已有研究表明二甲雙胍的抗炎作用是獨(dú)立于降糖作用之外。
　　2.通過(guò)分析本研究所獲得的腸道菌群ERIC-PCR指紋圖譜，正常人腸道菌群種類(lèi)多樣化，優(yōu)勢(shì)菌群數(shù)量較多，2型糖尿病患者腸道菌群結(jié)構(gòu)多樣性降低，且優(yōu)勢(shì)菌與健康人不