負責調控Brd4活性的HDAC鑒定.pdf

1、正性轉錄延伸因子P-TEFb是由CDK9及其調節(jié)亞基Cyclin T1組成的異二聚體激酶,廣泛存在于真核生物中。研究證明:P-TEFb是基因轉錄從起始階段進入到有效延伸階段的必需因子,與艾滋病、心肌肥大和腫瘤發(fā)生均有密切的關系。在RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)主導的mRNA轉錄過程中,P-TEFb被選擇性募集到基因啟動子區(qū),進而磷酸化PolⅡ及延伸抑制因子,刺激全長mRNA的高效轉錄。在真核細胞內,P-TEFb以無活性和有活性(可募集)兩種

2、復合物形式存在。本實驗室的前期研究發(fā)現(xiàn),細胞在受到外界脅迫因素刺激后,可以激活細胞內鈣離子依賴性蛋白磷酸酶PP2B以及蛋白磷酸酶PPl兩條信號途徑,通過蛋白磷酸酶PP2B和PP1的協(xié)同去磷酸化作用,致使無活性復合物解離,從而釋放P-TEFb。被釋放的P-TEFb通過與募集因子溴結構域蛋白Brd4的結合、被選擇性的募集到基因啟動子區(qū),調節(jié)相關基因的轉錄?？梢?Brd4對于P-TEFb的募集和發(fā)揮調節(jié)轉錄功能起到了至關重要的作用。因此,Br

3、d4調控P-TEFb募集機制的研究對于我們深入研究基因表達具有非常重要的意義。Brd4的兩個串聯(lián)的溴結構域可通過識別核小體乙?；M蛋白而結合于染色質上。我們前期報道已證明,當細胞受到刺激后,Brd4可以從染色質上解離下來,進而與已經(jīng)活化的P-TEFb結合,并將P-TEFb募集到基因啟動子區(qū),從而調控應激性基因的轉錄表達(我們將該過程稱為Brd4的應激活化);并發(fā)現(xiàn)用特異的組蛋白去乙?；?HDAC)抑制劑TSA預處理細胞,會抑制Brd4

4、的應激活化,顯示HDACs信號途徑參與了這個過程。在哺乳動物細胞中,共有11個HDACs基因,分為4大類。然而調控Brd4應激活化的特異HDACs類型還不清楚。
　　 本文研究目標是甑別與鑒定調控Brd4應激活化相關HDACs信號途徑的特異HDACs類型。我們首先采用MS-275預處理細胞,發(fā)現(xiàn)可以抑制Brd4的應激活化。MS-275是針對HDACⅠ類(主要是HDAC1,2,3)的特異性抑制劑,因此我們推測上述現(xiàn)象的發(fā)生是與HD

5、ACⅠ類有關的。為了檢驗這個推測,我們克隆了針對HDAC1,2,3的shRNA,采用病毒包裝感染細胞抑制HDAC1,2,3的表達。結果發(fā)現(xiàn)單抑制其中一個或兩個HDACs都不能阻斷Brd4的應激活化,必須是同時抑制三個HDACs才能起到阻斷效果。表明HDAC1-3都參與了Brd4應激活化的調控。接下來我們用過表達無活性HDACs(即對HDACs進行定點突變),發(fā)現(xiàn)過表達HDAC1+3或2+3均可阻斷Brd4的應激活化,而過表達HDAC1+

6、2則不能抑制這個過程。這些結果顯示HDACs具有功能性冗余。有趣的是,這也說明無活性HDAC3突變體與無活性HDAC1或2突變體共同作用就足以抑制信號引起的Brd4應激活化,提示HDAC1和HDAC2可能共用一個調節(jié)亞基或是兩者形成了一個復合物。意外的是,共表達HDAC1,2,3并不能直接導致Brd4的活化。提示Brd4的應激活化可能還需要另外一條途徑的協(xié)同或過表達的HDAC1,2,3本身也需要被應激活化,才能有效調控Brd4的活化。尤