賴氨酸突變對(duì)Hsf4b轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控.pdf

1、背景：先天性白內(nèi)障是指發(fā)生在出生前后的以晶狀體渾濁為主要臨床癥狀的一類眼疾病,失明兒童中有22-30％為先天性白內(nèi)障所致。基因遺傳障礙是導(dǎo)致先天性白內(nèi)障的主要病因,其中以常染色體顯性遺傳最多。
　　Hsf4是調(diào)控晶狀體早期發(fā)育的關(guān)鍵因子,應(yīng)用基因掃描技術(shù)發(fā)現(xiàn)其DNA結(jié)合域錯(cuò)譯突變以及發(fā)生在內(nèi)含子和外顯子剪接處的終止密碼子突變與人和動(dòng)物家族遺傳性白內(nèi)障的發(fā)生密切相關(guān)。敲除小鼠Hsf4基因能誘發(fā)新生期小鼠白內(nèi)障。Hsf4主要參與調(diào)控新

2、生期晶狀體上皮細(xì)胞的增生和纖維細(xì)胞分化。但是,在晶狀體發(fā)育過程中,調(diào)控Hsf4轉(zhuǎn)錄活性的分子機(jī)理還不清楚。
　　Hsf4有Hsf4a和Hsf4b兩種亞型,Hsf4b是調(diào)節(jié)小鼠晶狀體發(fā)育的唯一亞型。在晶狀體組織中,Hsf4b參與上調(diào)晶狀體熱休克蛋白(Hsp25、β-晶體蛋白和γ-晶體蛋白)和晶狀體細(xì)胞骨架蛋白(P49、vimentin和skap2等)的表達(dá),同時(shí)下調(diào)FGFs家族成員的表達(dá)。這說明Hsf4b對(duì)其下游靶基因具有轉(zhuǎn)錄激活和

3、轉(zhuǎn)錄抑制的雙重作用。其雙重轉(zhuǎn)錄活性受磷酸化調(diào)控,磷酸化S299位點(diǎn)可增加Hsf4b類泛素化,抑制Hsf4b的轉(zhuǎn)錄活性。我們前期的研究結(jié)果顯示磷酸化S299位點(diǎn)可增加Hsf4b與Daxx蛋白結(jié)合,Daxx可抑制Hsf4b對(duì)下游基因Hsp25的表達(dá)調(diào)控。此外,我們還發(fā)現(xiàn)調(diào)控晶狀體發(fā)育的主要生長(zhǎng)因子FGF2參與調(diào)控Hsf4b蛋白穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性。FGF2通過激活ERK1/2誘導(dǎo)Hsf4b磷酸化和類泛素化從而促進(jìn)Hsf4b的轉(zhuǎn)錄活性。Hsf4b

4、類泛素化主要發(fā)生在賴氨酸分子上,賴氨酸也是易被其它修飾如乙?；头核鼗陌被?。在Hsf4b分子中含有多個(gè)賴氨酸分子。那么,這些賴氨酸分子在晶狀體發(fā)育過程中如何被修飾以及它們調(diào)控Hsf4b轉(zhuǎn)錄活性和蛋白穩(wěn)定性的機(jī)理還不清楚。我們應(yīng)用GPS蛋白類泛素化和乙?；治龀绦?qū)sf4b蛋白序列進(jìn)行預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)有K64、K206、K224、K287、K293、K336、K434位點(diǎn)被修飾的可行性最高。應(yīng)用定點(diǎn)突變方法對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行突變,把這些突變體

5、以及野生Hsf4b分別轉(zhuǎn)入Hsf4-/-小鼠晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi),然后再測(cè)定下游Hsp25和alpha B-crystallin蛋白的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變后K64G、K206G和K2224G對(duì)Hsf4b有抑制作用而K287G、K293G、K336G和K434G對(duì)Hsf4b有激活作用。目前,這些位點(diǎn)調(diào)控Hsf4b轉(zhuǎn)錄活性的機(jī)理正在研究中。
　　目的：選取不同的賴氨酸位點(diǎn)進(jìn)行突變之后研究能調(diào)控Hsf4b轉(zhuǎn)錄活性的賴氨酸及相關(guān)信號(hào)通路,為早期

6、診斷和治療與Hsf4b突變相關(guān)的先天性白內(nèi)障提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.設(shè)計(jì)并合成七對(duì)包含突變位點(diǎn)的引物,分別將 Hsf4b上的192bp、618bp、672bp、861bp、879bp、1008bp和1302bp位的AAG/AAA突變成GGC。
　　2.以pWZL-blast-HA-Hsf4b質(zhì)粒為模板,用包含突變位點(diǎn)的引物進(jìn)行擴(kuò)增,獲得7個(gè)突變質(zhì)粒。
　　3.測(cè)序正確后,將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)293-pho

7、enix細(xì)胞中,用其分泌的含有病毒的上清感染mLEC/Hsf4b-/-細(xì)胞,并用藥物Blasticidin進(jìn)行篩選,獲得持續(xù)且穩(wěn)定表達(dá)突變型Hsf4b的細(xì)胞株。
　　4.用Western blot檢測(cè)突變后Hsf4b的表達(dá)情況,并檢測(cè)下游蛋白Hsp25和αB-晶體蛋白的表達(dá)差異。
　　5.通過Luciferase assay實(shí)驗(yàn),來驗(yàn)證Hsf4b/K64G和Hsf4b/K293G下游基因αB-晶體蛋白(alpha B-cry

8、stallin)的表達(dá)差異。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建了7個(gè)真核表達(dá)Hsf4b的突變體質(zhì)粒。
　　2.篩選出了持續(xù)且穩(wěn)定表達(dá)野生型Hsf4b和突變型Hsf4b的細(xì)胞株。
　　3.突變型Hsf4b蛋白表達(dá)量與野生型Hsf4b沒有差異。Hsf4b下游蛋白Hsp25和αB-晶體蛋白在mLEC/HA-Hsf4b/K287G、mLEC/HA-Hsf4b/K293G, mLEC/HA-Hsf4b/K336G和mLEC/H

9、A-Hsf4b/K434G細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)明顯高于其在mLEC/HA-Hsf4b細(xì)胞內(nèi)的表達(dá),而在mLEC/HA-Hsf4b/K64G, mLEC/HA-Hsf4b/K206G和mLEC/HA-Hsf4b/K224G細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)則明顯低于其在mLEC/HA-Hsf4b細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。
　　4. Luciferase assay實(shí)驗(yàn)初步說明了Hsf4b/K64G能明顯抑制αB-晶體蛋白(alpha B-crystallin)基因啟動(dòng)子的活