FABP4基因啟動(dòng)子活性分析及同型半胱氨酸對(duì)其啟動(dòng)活性的調(diào)控作用.pdf

1、目的：研究同型半胱氨酸對(duì)人源FABP4啟動(dòng)子活性的影響及DNA甲基化調(diào)控的具體機(jī)制，以探索同型半胱氨酸致動(dòng)脈粥樣硬化可能的治療靶點(diǎn)。
　　方法：本課題分別以HEK-293A細(xì)胞及人源誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象。應(yīng)用生物信息學(xué)方法獲得并預(yù)測(cè)FABP4基因啟動(dòng)子區(qū)順式轉(zhuǎn)錄作用元件和反式作用因子的結(jié)果，以pGL3-basic為工具載體采用基因重組法構(gòu)建啟動(dòng)子截取片段，轉(zhuǎn)染HEK-293A細(xì)胞觀察不同截取片段的熒光素酶活性變化并分析不同截取片

2、段的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)活性功能。觀察不同濃度0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、500μmol/L的同型半胱氨酸及100μmol/L同型半胱氨酸+葉酸、VitB12和5-氮雜胞苷（AZC）干預(yù)腺病毒轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)錄活性最強(qiáng)的FABP4基因啟動(dòng)子截取片段中巨噬細(xì)胞熒光素酶活性變化。巢式降落式甲基化特異性PCR(ntMS-PCR)檢測(cè)FABP4啟動(dòng)子甲基化水平。
　　結(jié)果：構(gòu)建好插入pGL3-basic重組載體的截

3、取片段轉(zhuǎn)染HEK-293A細(xì)胞后測(cè)得熒光素酶活性顯示，與空載體pGL3對(duì)照組相比較，-1000/-1片段組啟動(dòng)活性沒(méi)有明顯改變；-500/-1片段組和-2000/-1片段組啟動(dòng)活性明顯增加，它們轉(zhuǎn)錄活性分別約為空載體pGL3對(duì)照組的2.5倍（p<0.01）和3倍（p<0.01），而-2000/-1501片段組是空載體pGL3對(duì)照組的1.5倍（p<0.01），-2000/-1片段組轉(zhuǎn)錄活性最強(qiáng)；-2000/-1片段組轉(zhuǎn)錄活性約為-500/

4、-1片段組片段組的1.2倍（p<0.01）。對(duì)照載體pRL-TK所攜帶的啟動(dòng)子是HSV1-TK基因自身啟動(dòng)子,FABP4基因啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性均在TK啟動(dòng)活性的40％以下。
　　不同濃度Hcy作用FABP4基因啟動(dòng)子（-2000/-1）后，與0μmol/L Hcy濃度組比較，50μmol/L Hcy濃度組啟動(dòng)活性略有降低，500μmol/L Hcy濃度組啟動(dòng)活性明顯降低，均無(wú)顯著性差異；100μmol/L Hcy濃度組和200μmo

5、l/L Hcy濃度組啟動(dòng)活性明顯升高，100μmol/L Hcy濃度組約為0μmol/L Hcy濃度組和500μmol/L Hcy濃度組的3倍（p<0.01），約為50μmol/L Hcy濃度組的4倍（p<0.01）；與0μmol/L Hcy濃度組比較，用甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑AZC作用后，F(xiàn)ABP4基因啟動(dòng)活性增高3倍，差異有顯著性（p<0.01）；與100μmol/L Hcy濃度組比較，給予葉酸和VitB12干預(yù)后，啟動(dòng)子啟動(dòng)活性大約降

6、低10%，差異有顯著性（p<0.01）。
　　DNA甲基化狀態(tài)的改變可以影響基因的轉(zhuǎn)錄。FABP4基因DNA甲基化狀態(tài)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，100μmol/L Hcy組甲基化水平下降了大約45.4%，具有顯著性差異(P<0.05)；葉酸和VitB12干預(yù)后甲基化水平較100μmol/L Hcy上升55.5%，具有顯著性差異(P<0.05)；AZC組較0μmol/L Hcy組甲基化程度低約1.5倍，具有顯著性差異(P<0.05

7、)。mRNA的表達(dá)是基因轉(zhuǎn)錄的第一步，F(xiàn)ABP4的mRNA的表達(dá)狀態(tài)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，100μmol/L Hcy組mRNA的表達(dá)水平上升了大約5倍，具有顯著性差異(P<0.01)；葉酸和VitB12干預(yù)后mRNA的表達(dá)水平較100μmol/L Hcy下降9倍，具有顯著性差異(P<0.01)；AZC組較對(duì)照組mRNA的表達(dá)高6倍，具有顯著性差異(P<0.01)。蛋白的產(chǎn)生是基因表達(dá)關(guān)鍵的最終階段也是產(chǎn)生具有活性蛋白質(zhì)的第一階段，

8、FABP4蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，100μmol/L Hcy組蛋白產(chǎn)生水平上升了大約2倍，具有顯著性差異(P<0.05)；葉酸和VitB12干預(yù)后蛋白產(chǎn)生水平較100μmol/L Hcy下降約20%，具有顯著性差異(P<0.05)；AZC組較對(duì)照組組蛋白表達(dá)增加約15%，具有顯著性差異(P<0.05)。
　　結(jié)論：FABP4基因啟動(dòng)子屬于弱啟動(dòng)子；FABP4基因核心啟動(dòng)子是由CAAT盒組成的，轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)位于轉(zhuǎn)錄起始上游