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文檔簡介
1、外泌體,一類直徑在50-150nm具有雙層膜結(jié)構(gòu)的細胞外囊泡,存在于生物的各種體液中。外泌體可以通過負載蛋白質(zhì)、多肽、mRNA、長鏈非編碼RNA、miRNA、環(huán)狀RNA以及tsRNA調(diào)節(jié)不同細胞的生物活性。目前,許多研究表明外泌體在腫瘤的形成、遷移和代謝方面發(fā)揮著重要作用,同時還與許多疾病的發(fā)生密切相關(guān)。
在精子發(fā)生的過程中,精原干細胞除了形成一個走向分化命運的精原細胞外,還會形成一個與自身相同仍舊擁有干性的細胞。在睪丸曲細精
2、管內(nèi)的“niche”微環(huán)境中,支持細胞分泌的各類因子對于精原干細胞的自我維持與更新發(fā)揮著重要的作用。附睪和精漿中的細胞外囊泡參與了精子發(fā)生的過程中,然而,在曲細精管內(nèi)支持細胞來源的胞外囊泡對精原干細胞的調(diào)節(jié)作用所知甚少。
本研究對支持細胞分泌的胞外囊泡進行了鑒定,并且探究了其對精原干細胞的影響,主要結(jié)果為:
(1)收集不同發(fā)育階段小鼠的睪丸,通過免疫組織化學的方法,在曲細精管內(nèi)對外泌體標志性蛋白質(zhì)CD63進行了定位。
3、發(fā)現(xiàn)在小鼠不同發(fā)育階段,CD63主要定位在支持細胞的細胞質(zhì),并且呈顆粒狀分布。同時,CD63在小鼠出生后前7d有很高的表達量,這表明含有CD63的陽性囊泡在精子發(fā)生的過程中發(fā)揮著重要作用。
(2)通過梯度離心和超速離心的方法,首次分離純化出原代支持細胞釋放的細胞外囊泡。在電鏡下可以觀察到囊泡具有雙層膜結(jié)構(gòu),并且通過納米顆粒跟蹤儀測量出囊泡的大小主要在76nm左右。利用蛋白質(zhì)免疫印跡發(fā)現(xiàn)分離出的囊泡含有外泌體的特異性蛋白質(zhì)CD6
4、3。因此,從形態(tài)特征、粒徑大小以及標志性蛋白質(zhì)這三個方面鑒定出這類囊泡主要是外泌體。
(3)用DiI對分離出的外泌體進行標記,發(fā)現(xiàn)DiI-外泌體可以附著在C18-4細胞以及原代精原干細胞的表面,呈現(xiàn)顆粒狀不均勻分布。
(4)在無血清的培養(yǎng)條件下添加100ng/μL外泌體培養(yǎng)24h,同時未添加外泌體的細胞作為對照組。發(fā)現(xiàn)加入外泌體后,C18-4細胞和原代精原干細胞的狀態(tài)良好,細胞飽滿,表面光滑,而對照組的細胞表面出現(xiàn)大
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