PLZF調(diào)控精原干細(xì)胞自我更新和分化的研究.pdf

1、本文主要從以下三個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分:
　　目的：構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP-N1-PLZF,為基因水平研究PLZF在精原干細(xì)胞增殖和分化中的調(diào)控機(jī)制提供理論參考。
　　方法：參考分子克隆技術(shù),采用RT-PCR的方法從大鼠睪丸組織中擴(kuò)增PLZF,將該基因連接克隆到含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)報(bào)告基因的真核表達(dá)載體pEGFP-N1上,以構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-N1-PLZF。
　　結(jié)果：實(shí)驗(yàn)從大鼠睪

2、丸組織中提取總RNA,以RT-PCR方法獲取編碼PLZF基因的全序列cDNA。構(gòu)建PLZF的cDNA真核表達(dá)質(zhì)粒時(shí)將能發(fā)出綠色熒光的EGFP報(bào)告基因融合在PLZF基因上,并經(jīng)酶切后DNA電泳鑒定及DNA測(cè)序證實(shí)結(jié)果。
　　結(jié)論：構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-N1-PLZF成功,實(shí)驗(yàn)中將能發(fā)出綠色熒光的EGFP報(bào)告基因融合在PLZF基因的3′端。提高了PLZF在真核細(xì)胞中的表達(dá),而且不影響其目的蛋白的結(jié)構(gòu)和功能,對(duì)研究PLZF調(diào)控精原干細(xì)

3、胞增殖和分化機(jī)制具有重要的意義。
　　第二部分:
　　目的：探討PLZF基因?qū)τ诖笫缶杉?xì)胞的體外分化調(diào)節(jié)作用。
　　方法：應(yīng)用pEGFP-N1-PLZF真核表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)大鼠精原干細(xì)胞, RT-PCR檢測(cè)PLZF和c-Kit mRNA表達(dá)情況,Western blot檢測(cè)PLZF蛋白和c-Kit蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：過(guò)表達(dá)PLZF基因72h后,半定量RT-PCR顯示:與對(duì)照組比較,PLZF mR

4、NA表達(dá)升高,c-Kit mRNA表達(dá)降低;Western blot蛋白分析顯示:PLZF蛋白表達(dá)升高,c-Kit蛋白表達(dá)降低。
　　結(jié)論：過(guò)表達(dá)PLZF基因可以抑制大鼠精原干細(xì)胞的體外分化,促進(jìn)精原干細(xì)胞保持未分化狀態(tài),為進(jìn)一步研究精原干細(xì)胞的分化調(diào)控打下了基礎(chǔ)。
　　第三部分:
　　目的：探討膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)對(duì)大鼠原代培養(yǎng)的精原干細(xì)胞的增殖和分化蛋白PLZF、c-Kit的基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)是否有影響

5、。
　　方法：用含不同濃度的GDNF(0、10、50、100ng/ml)的DMEM培養(yǎng)液原代培養(yǎng)大鼠精原干細(xì)胞。RT-PCR檢測(cè)精原干細(xì)胞中PLZF mRNA、c-Kit mRNA水平,Western印跡法檢測(cè)PLZF、c-Kit蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：GDNF在10ng/ml時(shí),其PLZF和c-Kit mRNA相比空白組無(wú)明顯變化;GDNF在50ng/ml時(shí),PLZF mRNA表達(dá)升高,c-Kit mRNA表達(dá)降低;當(dāng)G

6、DNF濃度為100ng/ml時(shí),其PLZF和c-Kit mRNA的表達(dá)與GDNF在50ng/ml時(shí)相比無(wú)明顯變化。GDNF在10ng/ml時(shí),其PLZF和c-Kit蛋白相比空白組無(wú)明顯變化;GDNF在50ng/ml時(shí),PLZF蛋白表達(dá)升高,c-Kit蛋白表達(dá)降低;當(dāng)GDNF濃度為100ng/ml時(shí),其PLZF和c-Kit蛋白的表達(dá)與GDNF在50ng/ml時(shí)相比無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論：GDNF隨著濃度的增加,可以促進(jìn)SSC的增殖,