苯并芘通過(guò)抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自我更新和分化能力影響骨折愈合的研究.pdf

1、背景：在骨折的愈合過(guò)程中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）對(duì)骨的再生起了重要作用。香煙中的主要成份苯并芘(Benzo[a]pyrene,BaP)是芳香烴受體（arylhydrocarbonreceptor,Ahr）的激動(dòng)劑,可以負(fù)性調(diào)控骨量和成骨分化。
　　目的：通過(guò)臨床標(biāo)本、動(dòng)物模型、體外實(shí)驗(yàn)的研究，分析 BaP對(duì) MSCs分化能力的影響及作用機(jī)制，探討B(tài)aP是否會(huì)抑制大鼠骨折愈合的進(jìn)程。

2、
　　方法：本實(shí)驗(yàn)總共分為三個(gè)部分1.收集來(lái)自吸煙人群的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human bone marrow mesenchymal stem,hBMSCs）檢測(cè)早期成骨標(biāo)志物堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色和活性，茜素紅S染色檢測(cè)晚期的鈣鹽沉積。檢測(cè)芳香烴受體和其靶基因細(xì)胞色素P4501B1(cytochrome p4501B1,CYP1B1)的表達(dá)情況，驗(yàn)證長(zhǎng)期吸煙人群的hBMSCs的Ahr

3、信號(hào)通路是否被激活。
　　用BaP處理C3H10T1/2和原代大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow derived mesenchymal stem cells,BM-MSCs)，利用MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MSCs的增殖及自我更新能力,利用油紅O染色，檢測(cè)MSCs成脂分化能力，化學(xué)發(fā)光和細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)ALP變化，茜素紅S染色檢測(cè)鈣鹽沉積，觀察MSCs的成骨分化能力。Western Blot檢測(cè)Ahr信號(hào)相關(guān)分子的表達(dá)情

4、況。為進(jìn)一步明確其具體機(jī)制，采用siAhr干擾Ahr信號(hào)通路，檢測(cè)siAhr對(duì)BaP作用下MSCs成骨分化能力：化學(xué)發(fā)光和細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)ALP變化；茜素紅S染色檢測(cè)鈣鹽沉積；Western Blot檢測(cè)成骨標(biāo)志物成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子（Runt-related transcription factor2,RUNX2），骨橋蛋白（Osteopontin,OPN）以及SMAD依賴信號(hào)通路TGF-β1/SMAD4和非SMAD信號(hào)依賴通路TGF-

5、β1/ERK/AKT的表達(dá)情況。BaP激活A(yù)hr信號(hào)通路的同時(shí)采用TGF-β1抑制劑（LY2157299）驗(yàn)證TGF-β1通路的作用。
　　2.白藜蘆醇作為Ahr的天然抑制劑，與BaP共同作用后分別檢測(cè)成骨分化能力和相關(guān)信號(hào)通路的表達(dá)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，首先構(gòu)建大鼠染毒和骨折模型，Western Blot檢測(cè)BM-MSCs的CYP1B1的表達(dá)情況，確保染毒模型構(gòu)建成功，X線和 HE檢測(cè)骨折愈合情況。用白藜蘆醇與BaP共同作用于大鼠，觀察骨

6、折愈合情況。
　　3.骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone Morphogenetic Proteins,BMPs）作為成骨誘導(dǎo)因子，與BaP共同作用后檢測(cè)成骨分化能力的變化。
　　結(jié)果：吸煙人群的hBMSCs自我更新及成骨分化能力減弱，并且激活A(yù)hr信號(hào)通路以及上調(diào)Ahr的靶基因CYP1B1的表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，BaP抑制MSCs的自我更新及多向分化能力，主要是通過(guò)激活A(yù)hr信號(hào)通路抑制SMAD依賴信號(hào)通路TGF-β1/SMAD4和非

7、SMAD信號(hào)依賴通路TGF-β1/ERK/AKT。白藜蘆醇作為Ahr的天然抑制劑，可以抑制BaP對(duì)MSCs的損害。BMP2和BMP9可以抵消BaP抑制成骨分化的作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BaP可以抑制大鼠骨折愈合的進(jìn)程，并且這個(gè)作用會(huì)被白藜蘆醇挽救。
　　結(jié)論：
　　1.BaP通過(guò)激活A(yù)hr抑制TGF-β1/SMAD4和TGF-β1/ERK/AKT損傷MSCs的干性。白藜蘆醇可以拮抗Ahr抵消BaP的影響。
　　2.Ba