同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療兔橈骨骨折不愈合的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、盡管骨科近年來(lái)發(fā)展迅速，但骨折不愈合仍是臨床中面臨的一個(gè)重要問(wèn)題，在正常的骨折愈合過(guò)程中，未分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在骨形態(tài)蛋白(BMPs)和調(diào)節(jié)因子的影響下增值，分化成軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞，最終形成骨，達(dá)到修復(fù)損傷。然而一部分骨折沒(méi)有由于沒(méi)有完成修復(fù)過(guò)程，最終導(dǎo)致延遲愈合或者不愈合，增加手術(shù)次數(shù)，延長(zhǎng)住院時(shí)間。骨折不愈合的診斷是建立在一系列臨床癥狀和物理檢查上的，它包括疼痛，骨折端的活動(dòng)以及放射學(xué)檢查。骨折治療6－8個(gè)月后仍沒(méi)有愈合考慮骨折

2、不愈合，不同部位的發(fā)病率約5％-20％。
　　 近年來(lái)隨著干細(xì)胞培養(yǎng)、分離等技術(shù)的發(fā)展使骨折不愈合的治療有了更多的選擇。從骨髓提取分離、純化間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenehymalstemcells，MSCs)能演變?yōu)槎喾N組織細(xì)胞，在多種因素的刺激下可分化為幾乎各種中胚層細(xì)胞，如骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等，可作為各種組織修復(fù)的選擇。本實(shí)驗(yàn)即以同種異體兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)兔骨折不愈合模型，觀察其修復(fù)兔橈骨骨折不愈合模型的效果，從而

3、探討同種異體MSCs的體內(nèi)修復(fù)骨折不愈合的機(jī)制，為進(jìn)一步使用同種異體MSCs治療骨折不愈合提供實(shí)驗(yàn)支持。
　　 目的：
　　 研究兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)、純化方法，以及觀察兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)情況。用兔橈骨制作骨折不愈合的模型。通過(guò)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增，治療兔橈骨骨折不愈合模型，研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療骨折不愈合的效果及機(jī)制，以及不同數(shù)量的細(xì)胞移植對(duì)骨折不愈合的影響。從而進(jìn)一步為人自體、異體骨髓間

4、充干細(xì)胞的體外培養(yǎng)應(yīng)用治療骨折不愈合提供依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、用Brownlow法制做新西蘭大白兔橈骨骨折不愈合模型，將其一側(cè)橈骨干中遠(yuǎn)1/3截?cái)?，去?mm骨質(zhì)及骨膜，用骨蠟封閉骨折端，使骨折保持5mm的間隙。術(shù)后8周，使其形成兔橈骨萎縮性骨折不愈合的模型。
　　 2、采用貼壁篩選法從兔股骨近端髓腔骨髓組織中分離、純化BMSCs，進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增，應(yīng)用免疫組化染色方法對(duì)細(xì)胞表型、純度進(jìn)行鑒定。

5、　　 3、將培養(yǎng)的細(xì)胞低溫保存，待骨折不愈合模型完成后，復(fù)蘇MSCs，擴(kuò)增培養(yǎng)，消化培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞，PBS洗滌后，計(jì)數(shù)，制成細(xì)胞濃度為1×106/ml的細(xì)胞懸液，將骨折不愈合模型隨機(jī)分為3組，A組給予不愈合部位0.2ml細(xì)胞懸液注射。B組給予不愈合部位0.4ml細(xì)胞懸液注射。C組不愈合部位僅打通髓腔。分別在給予MSCs移植治療4周和8周行X線檢查，觀察骨折愈合情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、骨折不愈合模型制作術(shù)后8周，

6、影像學(xué)和組織學(xué)檢查，其形成類似于臨床萎縮性骨折不愈合的模型。
　　 2、培養(yǎng)的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞多為為短梭形或紡錘形，典型的為漩渦狀排列，比較均一；采用免疫細(xì)胞化學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞表面抗原CD44，不表達(dá)CD34，證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞為兔BMSCs。
　　 3、BMSCs移植治療骨折不愈合術(shù)后8周行X線檢查和組織學(xué)顯示：A組中7只兔橈骨骨折愈合，3只未愈合；B組中9只兔橈骨骨折愈合，1只未愈合；C組中