同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療血管性癡呆大鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定與標(biāo)記
　　[目的]探討大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Mesenchymal StemCells，BMSCs)體外分離、培養(yǎng)、純化、傳代、鑒定和標(biāo)記的方法，為進(jìn)行BMSCs移植治療血管性癡呆(Vascular dementia，VD)大鼠模型提供功能穩(wěn)定的種子細(xì)胞。
　　[方法]采用全骨髓細(xì)胞培養(yǎng)貼壁篩選法在體外分離培養(yǎng)大鼠BMSCs，相差顯微鏡觀察BMSCs細(xì)胞

2、形態(tài)，透射電鏡觀察BMSCs超微結(jié)構(gòu)并繪制生長(zhǎng)曲線，使用地塞米松等物質(zhì)誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞兩個(gè)方向分化。用BrdU對(duì)BMSCs進(jìn)行體外標(biāo)記，通過免疫組化染色觀察并計(jì)算BrdU陽(yáng)性細(xì)胞標(biāo)記率。①選取3-4W齡SD大鼠，從其股骨中取材，在無菌條件下操作，用剪刀剪去股骨的兩端，暴露骨髓腔，用含15％胎牛血清(FBS)的DMEM-LG完全培養(yǎng)基從骨髓腔中沖出骨髓于平皿中，并用同樣含15％ FBS的DMEM-LG完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，用消化控制和

3、全骨髓細(xì)胞貼壁分離法分離純化BMSCs，觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)，相差顯微鏡觀察BMSCs的細(xì)胞形態(tài)，透射電鏡觀察BMSCs超微結(jié)構(gòu)并繪制生長(zhǎng)曲線。②取生長(zhǎng)旺盛的第3代細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs表面抗原CD34(PE標(biāo)記)、CD90（FITC標(biāo)記）、CD44（FITC標(biāo)記）及同型對(duì)照小鼠抗大鼠IgG1型單克隆抗體（分別為PE和FITC標(biāo)記）。并分別以誘導(dǎo)其向骨細(xì)胞分化及向脂肪細(xì)胞分化的方法對(duì)分離擴(kuò)增的BMSCs進(jìn)行鑒定。③用5-溴-2'-脫

4、氧尿嘧啶核苷(BrdU)免疫組化染色方法對(duì)第3代細(xì)胞BMSCs進(jìn)行體外標(biāo)記，通過免疫組化染色觀察并計(jì)算BrdU陽(yáng)性細(xì)胞標(biāo)記率。
　　[結(jié)果]①原代培養(yǎng)的SD大鼠BMSCs為大小不等圓形細(xì)胞。純化、擴(kuò)增后BMSCs呈均勻一致的長(zhǎng)梭型，傳代后的BMSCs形態(tài)趨于均一，排列有序，呈魚群樣或漩渦狀排列。BMSCs超微結(jié)構(gòu)見SD大鼠BMSCs細(xì)胞體積較小，核質(zhì)比例較大，細(xì)胞核呈橢圓形，也可見不規(guī)則形，核仁1～2個(gè)，大而明顯，核染色質(zhì)較疏松，

5、細(xì)胞表面可見有較多微絨毛，胞質(zhì)中可見較豐富的細(xì)胞器，如線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體。傳代周期為8～9d，細(xì)胞接種后1～2 d為滯留期，3d后達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第6天進(jìn)入平臺(tái)期。②流式細(xì)胞儀檢測(cè)第3代細(xì)胞示，CD44陽(yáng)性率為89.4％、CD90為99.2％,CD34為1.82％。經(jīng)誘導(dǎo)BMSCs向骨細(xì)胞分化后，茜素紅S染色可見鈣結(jié)節(jié)陽(yáng)性。經(jīng)誘導(dǎo)BMSCs向脂肪細(xì)胞分化后，油紅O染色，蘇木素復(fù)染，細(xì)胞內(nèi)可見圓形脂滴空泡，被油紅O染成特異性橘紅色

6、。③10μmol/LBrdU體外呼育48h后BrdU陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃或黃褐色，陽(yáng)性反應(yīng)物位于細(xì)胞核，標(biāo)記率為89％～92％。
　　[結(jié)論]體外BMSCs易于分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增。體外培養(yǎng)的BMSCs有獨(dú)特的超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。BMSCs可通過誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化。用BrdU標(biāo)記BMSCs的濃度為10μmol/L，時(shí)間為48h。
　　第二部分同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞立體定位海馬移植治療血管性癡呆大鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究
　　[目的

7、]研究立體定位海馬移植同種異體BMSCs，對(duì)VD大鼠模型的學(xué)習(xí)記憶功能障礙改善的療效、腦組織病理學(xué)改變、腦組織中移植BMSCs的存活遷移情況等的影響。
　　[方法]①用2-VO法制作血管性癡呆大鼠模型，將11～13月齡的SD大鼠隨機(jī)分成3組:假手術(shù)組10只，暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈但不結(jié)扎;培養(yǎng)組基對(duì)照15只，結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈（2-VO），30d后腦立體定位將10μl PBS注入大鼠海馬內(nèi);BMSCs移植組15只，2-VO30d后腦立體定

8、位將1×106BMSCs移植入大鼠海馬內(nèi)。②飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)大鼠4w后以Morris水迷宮作定位航行試驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。③HE染色后光鏡下觀察各組大鼠海馬區(qū)和額葉皮質(zhì)的病理變化。④免疫組織化學(xué)染色觀察BrdU標(biāo)記的BMSCs在VD大鼠腦組織中的存活及遷移情況進(jìn)行研究。
　　[結(jié)果]①造模前各組大鼠Morris水迷宮檢測(cè)成績(jī)差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，海馬定位移植4w后，模型對(duì)照組與假手術(shù)組比較，平均逃避潛伏期長(zhǎng)(P＜0.

9、01)，且60s內(nèi)在平臺(tái)象限滯留時(shí)間短(P＜0.01)。BMSCs移植組逃避潛伏期比模型對(duì)照組明顯縮短(P＜0.01)，BMSCs移植組在平臺(tái)象限滯留時(shí)間較模型對(duì)照組長(zhǎng)(P＜0.05)。但都達(dá)不到假手術(shù)組的水平(P＜0.01)。②光鏡下可見模型對(duì)照組大鼠海馬及額葉皮質(zhì)的細(xì)胞排列不齊，細(xì)胞核固縮，胞質(zhì)密度增高，細(xì)胞脫失。而BMSCs移植組上述病理改變較輕。③BMSCs移植組經(jīng)海馬定位移植BMSCs4w后，可在實(shí)驗(yàn)大鼠海馬觀察到呈棕黃或黃褐

10、色的BrdU標(biāo)記BMSCs，有局灶聚集現(xiàn)象。額葉也見少量分散的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞。
　　[結(jié)論]①BMSCs海馬定位移植治療使VD模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力得到改善，但未達(dá)到假手術(shù)組水平。②BrdU免疫組化染色證實(shí)海馬定位移植的BMSCs能在海馬存活，并且能夠在移植大鼠腦內(nèi)遷移。
　　第三部分甘露醇預(yù)處理后靜脈移植同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療血管性癡呆大鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究
　　[目的]研究甘露醇預(yù)處理對(duì)同種異體BMSCs靜脈

11、移植治療VD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙改善療效的影響，通過觀察實(shí)驗(yàn)大鼠腦組織腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)含量、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及海馬膽堿能系統(tǒng)活性，探討甘露醇預(yù)處理后BMSCs靜脈移植治療VD模型大鼠療效的機(jī)制。
　　[方法]①造模成功后將VD模型大鼠隨機(jī)分成模型對(duì)照組8只（注射1ml無血清培養(yǎng)基）、BMSCs移植組11只（注射1×106個(gè)BMSCs1ml）及甘露醇預(yù)處理BMSCs移植組9只（注射1.5g/kg甘露醇后

12、，在10-30分鐘之內(nèi)注射1×106個(gè)BMSCs1ml）。還設(shè)假手術(shù)組7只，暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈，但不結(jié)扎即縫合，不進(jìn)行任何干預(yù)。②移植后籠養(yǎng)實(shí)驗(yàn)大鼠4w后，Morris水迷宮作定位航行試驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。③HE染色觀察大腦病理結(jié)構(gòu)的變化。④ELISA法檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)大鼠腦組織BDNF含量變化。⑤ELISA法檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)大鼠腦組織VEGF的含量變化。⑥檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠海馬膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)和乙酰膽堿酯酶(ACh

13、E)的活性。
　　[結(jié)果]①BMSCs靜脈移植4w后，大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試結(jié)果顯示，甘露醇預(yù)處理后BMSCs移植組和BMSCs移植組的逃避潛伏期均較培養(yǎng)基對(duì)照組明顯縮短（分別p＜0.01，p＜0.05），平臺(tái)象限平均滯留時(shí)間均延長(zhǎng)（分別p＜0.01，p＜0.05）;甘露醇預(yù)處理后BMSCs移植組的逃避潛伏期比BMSCs移植組更明顯縮短，平臺(tái)象限平均滯留時(shí)間更長(zhǎng)(p＜0.001);甘露醇預(yù)處理后BMSCs移植組的的逃避潛伏期和平

14、臺(tái)象限平均滯留時(shí)間與假手術(shù)組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。②BMSCs移植組額葉皮質(zhì)組織HE染色病理片顯示其病理?yè)p傷較培養(yǎng)基對(duì)照組輕，神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量較多，神經(jīng)元腫脹、脫失及核固縮現(xiàn)象減少，而以甘露醇預(yù)處理后BMSCs移植組的病理?yè)p傷更輕。③BMSCs移植組海馬和額葉組織BDNF含量高于培養(yǎng)基對(duì)照組(P＜0.05);甘露醇預(yù)處理BMSCs移植組海馬和額葉BNDF含量不但高于培養(yǎng)基對(duì)照組(P＜0.05)，而且比BMSCs移植組更高(P

15、＜0.05);但是，尚未達(dá)到假手術(shù)組的水平（P＜0.05）。④甘露醇預(yù)處理BMSCs移植組、BMSCs移植組額葉組織VEGF含量均值比培養(yǎng)基對(duì)照組顯著增高(P=0.000);甘露醇預(yù)處理BMSCs移植組額葉VEGF含量比BMSCs移植組更高(P=O.000);與假手術(shù)對(duì)照組比較，培養(yǎng)基對(duì)照組大鼠額葉VEGF含量也升高(p=0.006)。⑤培養(yǎng)基組大鼠海馬組織AChE和ChAT活性較假手術(shù)組明顯減弱(P＜0.05); BMSCs移植組大鼠

16、海馬組織AChE和ChAT活性較培養(yǎng)基組有明顯增強(qiáng)(P＜0.05);甘露醇預(yù)處理BMSCs移植組大鼠海馬組織AChE和ChAT活性不僅比培養(yǎng)基組有更顯著增強(qiáng)(P＜0.05)，而且比BMSCs移植組也顯增強(qiáng)(P＜0.05)。
　　[結(jié)論]用甘露醇預(yù)處理后靜脈移植同種異體BMSCs能使VD模型大鼠的學(xué)習(xí)及記憶能力的改善比單純靜脈移植BMSCs更明顯。BMSCs靜脈移植可減輕大腦的病理性損傷，而甘露醇預(yù)處理后行BMSCs靜脈移植的病理?yè)p