骨髓間充質(zhì)干細胞移植對血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的影響機制.pdf

1、目的: 本研究通過將骨髓間充質(zhì)干細胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)移植到血管性癡呆(vasculardementia，VD)大鼠，從行為學(xué)、形態(tài)學(xué)和自由基等不同層面觀察BMSCs移植對VD大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的影響，探討其作用機制。 方法: 將雄性Wistar大鼠20只隨機分為以3組：①假手術(shù)組6只②VD模型組6只③BMSCs移植組8只。VD模型組、BMSCs移植組均采用

2、兩血管阻斷法(2-VO)制備VD模型。 造模后1周，將標(biāo)記了熒光素的BMSCs經(jīng)鼠尾靜脈移植到BMSCs移植組大鼠。各組術(shù)后4周開始6d的Morris水迷宮行為學(xué)測試，記錄1～5d每天的平均逃避路程、平均逃避潛伏期、平均逃避速度。第6d測試120s內(nèi)穿越原平臺次數(shù)和原平臺象限停留時間。水迷宮測試結(jié)束后各組大鼠斷頭取腦，應(yīng)用HE染色光鏡觀察各組大鼠海馬CA1、CA3、齒狀回(dentategyrus，DG)區(qū)細胞形態(tài)；應(yīng)用免疫組織

3、化學(xué)方法檢測海馬CA1、CA3、DG區(qū)的突觸素(SYN)蛋白表達情況；應(yīng)用TUNEL法染色觀察海馬區(qū)細胞凋亡情況；應(yīng)用Westernblot檢測海馬CA1區(qū)NMDAR1表達情況；應(yīng)用透射電鏡觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)突觸形態(tài)等超微結(jié)構(gòu)；應(yīng)用分光光度法檢測過氧化氫酶(CAT)、過氧化脂質(zhì)(MDA)。 結(jié)果: 1.造模4w后，經(jīng)冰凍切片觀察到BMSCs移植組大鼠海馬區(qū)有綠色的熒光物質(zhì)存在，證明經(jīng)鼠尾靜脈移植BMSCs成功。

4、 2.Morris水迷宮測試結(jié)果：水迷宮實驗1～5d，VD模型組、BMSCs移植組的平均逃避路程和平均逃避潛伏期長于假手術(shù)組(p<0.05)，BMSCs移植組的平均逃避路程和平均逃避潛伏期比VD模型組縮短(p<0.05)。假手術(shù)組、BMSCs移植組的平均逃避速度與VD模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。第6d120s內(nèi)穿越原平臺位置次數(shù)，VD模型組、BMSCs移植組的次數(shù)少于假手術(shù)組(p<0.05)；BMSCs移植組次數(shù)多于

5、VD模型組(p<0.05)。第6d原平臺象限停留時間，VD模型組、BMSCs移植組的停留時間少于假手術(shù)組(p<0.05)；BMSCs移植組的停留時間多于VD模型組(p<0.05)。 3.HE染色：VD模型組海馬CA1區(qū)細胞核染色加深，體積明顯縮小，間隙擴大，數(shù)量減少，排列疏松，胞核固縮、破裂，細胞界限不清。BMSCs移植組CA1區(qū)細胞部小分胞核深染，細胞體積稍微縮小，數(shù)量減少，可見間隙，細胞排列保持原有的規(guī)則，界限較為清楚，有少

6、量核固縮、破裂，有少量細胞可見核仁。VD模型組CA3區(qū)可見少量的細胞胞體縮小，胞核染色略加深；細胞間隙加大，有些細胞發(fā)生皺縮，損傷仍明顯，細胞排列基本保持原有規(guī)則，DG區(qū)細胞核染色略加深，細胞間隙加大。DG區(qū)細胞數(shù)量仍基本正常，細胞排列基本保持原有規(guī)則。BMSCs移植組海馬細胞CA3區(qū)和DG區(qū)的細胞中，CA3區(qū)有少量胞體縮小、胞核染色略加深，細胞排列基本保持原有規(guī)則，DG區(qū)少量胞體縮小，細胞數(shù)量仍基本正常。 4.免疫組化染色結(jié)果

7、：VD模型組大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)、DG區(qū)SYN蛋白表達低于假手術(shù)組大鼠(p<0.05)，BMSCs移植組海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)、DG區(qū)SYN蛋白表達量高于VD模型組，低于假手術(shù)組(p<0.05)。 5.TUNEL染色結(jié)果：假手術(shù)組海馬CA1區(qū)可見淡染的細胞輪廓，未見TUNEL染色陽性細胞：VD模型組海馬CA1區(qū)可見較為集中的凋亡陽性細胞。BMSCs移植組海馬CA1區(qū)可見極少量凋亡陽性細胞。 6.電鏡結(jié)果：VD模型組

8、突觸體積明顯減小，形態(tài)改變，為長形或不規(guī)則形；突觸前區(qū)變形，突觸小泡減少并聚集，線粒體變性，突觸前后膜增厚，融合，突觸間隙消失，失去其正常形態(tài)。BMSCs移植組的突觸體積增大，突觸小泡增多，部分突觸前后膜略見增厚，接近于正常，突觸間隙可辨認，仍有線粒體變性。 7.Westernblot結(jié)果：VD模型組海馬區(qū)CA1區(qū)NMDAR1蛋白表達水平明顯低于假手術(shù)組，BMSCs移植組大鼠海馬CA1區(qū)NMDAR1蛋白表達水平高于VD模型組，仍

9、于假手術(shù)組。 8.CAT檢測結(jié)果：VD模型組的CAT活性明顯低于假手術(shù)組(p<0.05)，BMSCs移植組CAT活性明顯高于VD模型組(p<0.05)，但仍低于假手術(shù)組。 9.MDA檢測結(jié)果：VD模型組MDA含量明顯高于假手術(shù)組(p<0.05)；BMSCs移植組MDA含量低于VD模型組(p<0.05)，但仍高于假手術(shù)組。 結(jié)論: 1.從行為學(xué)、形態(tài)學(xué)及自由基等不同層面，通過對VD大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)

10、、DG區(qū)的SYN表達：CA1區(qū)的NMDAR1蛋白的表達情況分析，結(jié)果表明SYN、NMDAR1蛋白表達的增高有利于VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的恢復(fù)。 2.BMSCs有向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化的潛能，分化神經(jīng)細胞替代受損的神經(jīng)細胞，并上調(diào)表達bFGF、NGF、BDNF、GFAP，增加神經(jīng)生長因子分泌、抑制細胞凋亡、提高抗氧化能力、刺激內(nèi)源性神經(jīng)細胞再生、突觸連接的修復(fù)建立。BMSCs可以促進突觸的的再建、提高突觸再建的效能。使大鼠海馬突