骨髓間充質(zhì)干細胞移植對血管性癡呆大鼠行為學(xué)及鈣通道影響的研究.pdf

1、目的: 通過復(fù)制血管性癡呆（Vascular Dementia, VaD）大鼠模型并對其進行行為學(xué)和鈣通道相關(guān)信號通路檢測，探討VaD大鼠鈣通道信號通路的改變，分析其改變引起記憶認知障礙的可能機制。同時進一步探討骨髓間充質(zhì)干細胞（bone mesenchymal stem cells, BMSCs）移植對VaD大鼠認知功能的改善和鈣通道以及與鈣通道相關(guān)信號通路的影響機制，為BMSCs的臨床應(yīng)用提供適用性資料。
　　方法: （1）通

2、過貼壁篩選的方法分離、培養(yǎng)BMSCs，至第五代細胞純化后，用流式細胞儀對所培養(yǎng)BMSCs進行流式表面抗原鑒定，成纖維生長因子（basic fibroblast growth factorbfic，bFGF）和丁羥基茴香醚（Beta Hydroxy Acid，BHA）誘導(dǎo)BMSCs分化為神經(jīng)元細胞，并對誘導(dǎo)后的細胞，進行神經(jīng)巢蛋白(Nestin)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuron speeific enolase，NSE)表達的免疫組化

3、鑒定。誘導(dǎo)后的BMSCs于移植前24h在其培養(yǎng)液中加入濃度為10μmol/L的標記物5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine，BrdU)，離心收集標記后的BMSCs，備用。（2）提前進行大鼠水迷宮智力篩查，大鼠隨機分為對照組和模型組，模型組用改良Pulsinelli’s四血管阻斷法復(fù)制VaD模型，對照組只分離椎動脈和頸總動脈，不進行椎動脈凝閉和頸總動脈的夾閉。30天后篩選模型組中認知功能障礙的大鼠再分為模型對照

4、組和干細胞治療組。干細胞治療組將誘導(dǎo)后被BrdU標記的BMSCs細胞懸液通過腦立體定位儀注射到大鼠側(cè)腦室，對照組和模型對照組注射等量培養(yǎng)基。細胞移植30天后進行水迷宮行為學(xué)測試，各組大鼠斷頭取腦，制備石蠟切片，蘇木素-伊紅（Hematoxylin-eosin，HE）染色觀察大鼠大腦海馬區(qū)病理變化。（3）免疫組化染色方法檢測移植的細胞在大鼠腦組織的表達情況；檢測血漿和海馬組織一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase, NO

5、S）活性和NO含量；提取血細胞和海馬組織總RNA，Real-time PCR方法測定鈣調(diào)蛋白（Calmodulin，CaM）、鈣調(diào)蛋白依賴性激酶Ⅱ（Calcium/calmodulin-dependent protein kinaseII,CaMKII）和NOS mRNA表達含量；提取海馬組織總蛋白，BCA法進行蛋白定量，用蛋白免疫印跡(Western Blotting)法檢測鈣調(diào)蛋白依賴性激酶（CaMKⅡ）和與鈣通道相關(guān)的NOS蛋白酶

6、的表達情況。比較對照組、模型對照組組和干細胞治療組中各項指標，并對各組的含量做出差異性統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果: （1）通過貼壁篩選法分離培養(yǎng)BMSCs，體外傳代擴增后，流式細胞儀檢測第五代BMSCs表達粘附分子CD90陽性率99.4％，CD29陽性率96.8%，CD44陽性率99.6%，CD45陽性率3.7%。誘導(dǎo)后的BMSCs可表達NSE和Nestin。（2）模型對照組組和干細胞治療組與對照組相比，模型對照組組和干細胞治療組大鼠

7、平均逃避潛伏期明顯長于對照組，撤去平臺后，模型對照組和干細胞治療組第1次穿越平臺所用時間延長，穿越站臺次數(shù)明顯減少，存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。干細胞治療組較模型對照組逃避潛伏期縮短（P＜0.05），第1次穿越平臺時間縮短，穿越平臺次數(shù)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。（3）干細胞治療組在移植后30天大鼠腦組織雙側(cè)半球切片中可見BrdU染色陽性細胞分布，BrdU陽性反應(yīng)物呈棕褐色、顆粒狀或彌漫性分布，位于細胞核內(nèi)。（4）通過對比分析對照組、模

8、型對照組和干細胞治療組與鈣通道及鈣信號相關(guān)指標的表達差異，結(jié)果顯示模型對照組上述酶的活性、mRNA和蛋白表達水平較對照組高（P＜0.05），而干細胞治療組與模型對照組相比，CaMKⅡ、CaM、NOS和NO表達降低（P＜0.05）。
　　結(jié)論: （1）BMSCs在體外經(jīng)bFGF/BHA誘導(dǎo)可分化為神經(jīng)元樣細胞，且可表達Nestin和NSE。（2）VaD模型大鼠與鈣通道主要相關(guān)的NOS和CaMKII信號表達增高，提示鈣超載參與到了Va