血管性癡呆大鼠行為學(xué)及其發(fā)病機(jī)制的研究.pdf

1、目的：血管性癡呆(Vascular Dementia，VD)是老年期癡呆的主要類型之一，它是由一系列腦血管因素(缺血、出血、急慢性缺氧性腦血管病等)導(dǎo)致腦組織損害引起的以認(rèn)知功能障礙為特征的癡呆綜合癥，不僅給病人帶來(lái)長(zhǎng)期痛苦，嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量，而且給家庭、社會(huì)造成沉重負(fù)擔(dān)，因此研究VD的發(fā)病機(jī)制以指導(dǎo)其防治具有很高的社會(huì)價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是“一種臭雞蛋氣味的氣體”，H2S不僅有毒性作用，

2、它還廣泛參與機(jī)體多種生理和病理過(guò)程，因此被認(rèn)為是繼一氧化氮(nitric oxide，NO)、與一氧化碳(carbon monoxide，CO)后的第三類氣體信號(hào)分子。H2S不僅在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮重要的生理作用，而且還作為_(kāi)種內(nèi)源性的抗氧化劑，在氧化應(yīng)激時(shí)能夠清除羥自由基等活性氧簇，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞起保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)以VD大鼠模型為研究對(duì)象，觀察大腦缺血再灌注不同時(shí)間對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的損傷程度、血清中H2S含量的改變及海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡

3、率及凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)情況，從行為學(xué)、細(xì)胞凋亡及內(nèi)源性H2S表達(dá)量及其相互關(guān)系等方面，探討VD的發(fā)病機(jī)制，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)H2S這個(gè)新的氣體信號(hào)分子的作用，為VD的防治提供理論依據(jù)。 方法：選用純系健康雄性Wistar大鼠64只，將動(dòng)物隨機(jī)分為8組，正常組(Normal group)，假手術(shù)組(Sham-operated group)和VD模型組(VD group)，VD模型組又分為大腦缺血再灌注2小時(shí)組(IR 2h

4、 group)，大腦缺血再灌注8小時(shí)組(IR8h group)，大腦缺血再灌注24小時(shí)組(IR 24h group)，大腦缺血再灌注72小時(shí)組(IR 72h group)，大腦缺血再灌注168小時(shí)組(IR 168h group)和大腦缺血再灌注720小時(shí)組(IR 720hgroup)，每組8只動(dòng)物，采用四血管阻斷法(4-VO)制作VD大鼠模型，假手術(shù)組麻醉及手術(shù)過(guò)程與VD模型組相同，但不電凝雙側(cè)椎動(dòng)脈，不阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈。采用Morri

5、s水迷宮法測(cè)試各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，以逃避潛伏期為觀測(cè)指標(biāo)；制作大腦HE切片，采用光鏡觀察各組大鼠海馬CAl區(qū)的形態(tài)學(xué)變化；采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2及Bax的表達(dá)情況，采用Motic 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)測(cè)量海馬CAl區(qū)陽(yáng)性目標(biāo)平均光密度，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率；采用亞甲藍(lán)比色法檢測(cè)血清中H2S的含量，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：(1)行為學(xué)：隨著

6、訓(xùn)練天數(shù)的增加，各組大鼠的逃避潛伏期均縮短，第二天各組大鼠的逃避潛伏期開(kāi)始出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，IR 720h組與正常組和假手術(shù)組比較逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P＜0.01)；正常組和假手術(shù)組逃避潛伏期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。(2)形態(tài)學(xué)改變：假手術(shù)組大鼠海馬CAl區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞完整，結(jié)構(gòu)正常，胞漿豐富；細(xì)胞核呈圓形、橢圓形，無(wú)固縮或溶解現(xiàn)象；染色質(zhì)在核內(nèi)分布較均勻，間質(zhì)無(wú)水腫表現(xiàn)。VD模型組大鼠海馬CAl區(qū)可見(jiàn)大量神經(jīng)元變性，體積變小，胞

7、核與胞漿界限不清，核固縮成三角形或不規(guī)則形，而且隨缺血再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，變性神經(jīng)元數(shù)目越多。(3)細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)：VD模型組缺血再灌注2小時(shí)后Bcl-2蛋白平均光密度值開(kāi)始明顯上調(diào)，缺血再灌注8小時(shí)達(dá)到高峰，之后開(kāi)始下降，但I(xiàn)R 24h組仍高于假手術(shù)組(P＜0.05)；缺血再灌注早期Bax在海馬CA1區(qū)的表達(dá)明顯增強(qiáng)，隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)量不斷增加，IR 72～168h達(dá)高峰(P＜0.05)；隨缺血再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，Bcl-2

8、/Bax的比率逐漸降低。(4)海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率：VD模型組與假手術(shù)組比較，海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率均增加(P＜0.01)；VD模型組各組海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率各不相同(P＜0.01)；隨著缺血再灌注時(shí)間的延-長(zhǎng)，大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率逐漸增高，海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)對(duì)數(shù)曲線上升趨勢(shì)。(5)血清H2S含量：VD模型組與假手術(shù)組和正常組比較，血清中H2S含量減少(P＜0.01)；VD模型各組間血清H2S含量差異有顯著性(P＜0.01)；隨著缺血再灌

9、注時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠血清H2S含量逐漸降低，血清H2S含量呈現(xiàn)直線降低趨勢(shì)。(6)血清H2S含量與海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率相關(guān)分析：隨著血清HzS含量的降低，海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率逐漸升高，兩者呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)，回歸方程為：y=-0.135x+12.068，相關(guān)系數(shù)r=-0.861(P＜0.01)，提示內(nèi)源性H2S可能對(duì)海馬神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用。結(jié)論：腦缺血再灌注損傷可導(dǎo)致VD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的減退，海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡程度增強(qiáng)和血清中H2S含量減少；