清腦膠囊治療血管性癡呆的機(jī)制研究.pdf

1、目的：血管性癡呆(VD)指的是由腦血管病引起的有癡呆表現(xiàn)的臨床綜合征。隨著世界人口老齡化，VD發(fā)病率、致殘率、病死率均有升高，已成為威脅高齡人群健康的重要疾病之一，因此積極研究探索VD的發(fā)病機(jī)制及其治療有重要的醫(yī)學(xué)價(jià)值和社會(huì)意義。中藥清腦膠囊是依據(jù)中醫(yī)藥理論，以活血化瘀，化痰開竅為治療法則，結(jié)合多年臨床用藥經(jīng)驗(yàn)研制而成，臨床用于VD治療取得很好的療效。為探討清腦膠囊治療VD的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用VD小鼠模型及PC12細(xì)胞缺氧模型，研究了

2、清腦膠囊對(duì)VD小鼠腦內(nèi)單胺遞質(zhì)的含量及PC12細(xì)胞缺氧損傷的影響，初步探討其治療VD的療效及可能的作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.清腦膠囊對(duì)VD小鼠腦內(nèi)單胺遞質(zhì)的影響采用反復(fù)缺血再灌注方法制備VD小鼠模型。選取造模成功的小鼠分為模型對(duì)照組、清腦膠囊低劑量組（3.4g生藥/kg）、清腦膠囊中劑量組(6.8g生藥/kg)、清腦膠囊高劑量組(13.6g生藥/kg)及陽(yáng)性藥喜得鎮(zhèn)組(1.5mg/kg)，另設(shè)假手術(shù)組（手術(shù)及麻

3、醉同模型組，但雙側(cè)頸總動(dòng)脈不夾閉，尾部不放血），每組10只（模型組死亡1只），每日灌胃給藥1次，給藥容量為0.2mL/10g，連續(xù)給藥4周，假手術(shù)組與模型對(duì)照組灌服純水。
　　 1.1 學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè)于第1周、第2周、第3周、第4周灌胃給藥1小時(shí)后，應(yīng)用Morris水迷宮對(duì)各組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行測(cè)試：定位航行實(shí)驗(yàn)中計(jì)錄并比較各組小鼠逃避潛伏期、游泳路徑的平均值、朝向角；空間搜索實(shí)驗(yàn)中計(jì)錄并比較穿越平臺(tái)的次數(shù)、平臺(tái)象限的游泳

4、時(shí)間與總游泳時(shí)間的比值、平臺(tái)象限的游泳距離占總游泳距離的比值及朝向角。
　　 1.2 單胺遞質(zhì)檢測(cè)于第4周行為學(xué)測(cè)試完畢斷頭取腦，應(yīng)用熒光分光光度法檢測(cè)并比較各組小鼠腦內(nèi)單胺類遞質(zhì)去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)的含量。
　　 2.清腦膠囊及其含藥血清對(duì)PC12細(xì)胞缺氧損傷的影響
　　 2.1 清腦膠囊對(duì)PC12細(xì)胞缺氧損傷的影響
　　 2.1.1 清腦膠囊對(duì)PC12的細(xì)胞毒性

5、檢測(cè)藥物濃度梯度設(shè)定為1μg．L-1、10μg.L-1、100μg.L-1、500μg.L-1、1000μg．L-1、5000μg.L-1、10000μg.L-1、50000μg.L-1，作用時(shí)間為24h;MTT法測(cè)定各孔PC12細(xì)胞的增殖活性，以O(shè)D值表示。
　　 2.1.2 清腦膠囊最佳作用濃度與作用時(shí)間的確定清腦膠囊工作液作用濃度為如下濃度：10μg.L-1、50μg.L-1、100μg.L-1、250μg．L-1、500

6、μg．L-1、1000μg.L-1、2500μg.L-1，連二亞硫酸鈉終濃度為5mmol·L-1造模，在缺氧損傷發(fā)生16h后，與藥物共培養(yǎng)預(yù)孵育時(shí)間1、4、24h;采用MTT法進(jìn)行測(cè)定，確定藥物抑制損傷的最佳作用濃度與作用時(shí)間。按本實(shí)驗(yàn)確定的濃度為50μg.L-1、100μg.L-1、250μg.L-1，時(shí)間為24h;將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞分為模型對(duì)照組、50μg.L-1、100μg.L-1、250μg．L-1清腦膠囊組、無血清對(duì)照

7、組。連二亞硫酸鈉造模損傷16h后，觀察各劑量組細(xì)胞形態(tài)，采用MTT比色法、LDH活力測(cè)定法，比較各組對(duì)該模型的影響。
　　 2.2 清腦膠囊含藥血清對(duì)PC12細(xì)胞缺氧損傷的影響將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞分為模型對(duì)照組、5％含藥血清低、中、高劑量組、空白血清對(duì)照組，共5組。連二亞硫酸鈉造模損傷16h后，觀察各組細(xì)胞形態(tài)，采用MTT比色法、LDH活力測(cè)定法，比較含藥血清各組對(duì)該模型的保護(hù)作用。
　　 結(jié)果：
　　 1

8、.清腦膠囊對(duì)VD小鼠腦內(nèi)單胺類遞質(zhì)的影響
　　 1.1 定位航行實(shí)驗(yàn)與同一時(shí)間點(diǎn)的假手術(shù)組相比，模型組小鼠逃避潛伏期均顯著延長(zhǎng)(P＜0.01)，游泳路徑的平均值、朝向角均顯著增大(P＜0.01)；與同一時(shí)間點(diǎn)的模型組相比，清腦膠囊中劑量組（6.8g生藥/kg）及清腦膠囊高劑量組(13.6g生藥/kg)組逃避潛伏期均縮短(P＜0.05或P＜0.01)，游泳路徑的平均值、朝向角均減小(P＜0.05)；清腦膠囊低劑量組（3.4g生藥/

9、kg）各項(xiàng)指標(biāo)均有改善趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 空間搜索實(shí)驗(yàn)：與同一時(shí)間點(diǎn)的假手術(shù)組相比，模型組穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少(P＜0.01)，平臺(tái)象限的游泳時(shí)間與總游泳時(shí)間的比值、平臺(tái)象限的游泳距離占總游泳距離的比值均顯著減小(P＜0.01)，朝向角顯著增大(P＜0.01)；與同一時(shí)間點(diǎn)的模型組相比，清腦膠囊中劑量組(6.8g生藥/kg)及清腦膠囊高劑量組（13.6g生藥/kg）穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增多(P＜0.05或P

10、＜0.01)，平臺(tái)象限的游泳時(shí)間與總游泳時(shí)間的比值、平臺(tái)象限的游泳距離占總游泳距離的比值均明顯增大(P＜0.05或P＜0.01)，朝向角明顯減小(P＜0.05或P＜0.01)；清腦膠囊低劑量組(3.4g生藥/kg)各項(xiàng)指標(biāo)均有改善趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 1.2 單胺類遞質(zhì)檢測(cè)與假手術(shù)組相比，模型組小鼠腦組織中的NE、DA、5HT三種單胺遞質(zhì)含量均顯著下降(P＜0.01)；與模型組相比，清腦膠囊中劑量組(6.

11、8g生藥/kg)及清腦膠囊高劑量組(13.6g生藥/kg)組小鼠腦組織中的NE，DA、5-TH含量明顯增高（P＜0.05或P＜0.01）；清腦膠囊低劑量組(3.4g生藥/kg)較模型組三種單胺遞質(zhì)均有升高趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 2.清腦膠囊及其含藥血清對(duì)PC12細(xì)胞缺氧損傷的影響
　　 2.1 清腦膠囊對(duì)PC12細(xì)胞缺氧損傷的影響
　　 2.1.1 清腦膠囊對(duì)PC12的細(xì)胞毒性檢測(cè)清腦膠囊工

12、作液濃度達(dá)到10mg.mL-1時(shí)，OD值較正常對(duì)照組顯著降低(P＜0.01)，多數(shù)細(xì)胞腫脹，折光度減弱，最終細(xì)胞成團(tuán)、漂浮，鏡下可見許多細(xì)胞崩解物，提示藥物濃度大于10mg.mL-1時(shí)，出現(xiàn)明顯細(xì)胞毒作用。
　　 2.1.2 清腦膠囊最佳作用濃度與最佳作用時(shí)間的確定與無血清對(duì)照組相比，模型組OD值顯著降低(P＜0.01)；與模型組比，50μg.L-1預(yù)孵育24h;100μg.L-1預(yù)孵育4h、24h;250μg.L-1預(yù)孵育1h

13、、4h、24h;500μg.L-1預(yù)孵育4h可使OD值明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；10ug/L組預(yù)孵育1h、4h、24h;50μg.L-1預(yù)孵育1h、4h;500μg.L-1預(yù)孵育1h、24hOD值有升高趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。分析可知：清腦膠囊對(duì)PC12細(xì)胞缺氧損傷的最佳作用濃度為50μg．L-1、100μg．L-1、250μg.L-1；最佳預(yù)孵育時(shí)間為24h。
　　 2.1.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察正常對(duì)

14、照組PC12細(xì)胞細(xì)胞呈圓形，較少有突起，為貼壁細(xì)胞，折光性較強(qiáng)；模型組多數(shù)細(xì)胞腫脹，折光度減弱，最終細(xì)胞成團(tuán)、漂浮，并有許多細(xì)胞崩解物，50μg.L-1、100μg.L-1、250μg．L-1三組較模型組細(xì)胞數(shù)量較多，折光性明顯增強(qiáng)，細(xì)胞裂解碎片減少，多數(shù)細(xì)胞重新貼壁伸展。
　　 2.1.4 MTT法測(cè)定各組細(xì)胞活性與正常對(duì)照組相比，模型組OD值顯著降低(P＜0.01)；與模型組相比，清腦膠囊50μg．L-1、100μg.L-1

15、、250μg.L-1組預(yù)孵育24h，OD值明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 2.1.5 LDH活力測(cè)定與正常對(duì)照組相比，模型組LDH漏出量顯著增大(P＜0.01)；與模型組相比，清腦膠囊50ug.L-1、100μg.L-1、250μg.L-1組預(yù)孵育24h，LDH漏出量明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)，與MTT法結(jié)果一致。
　　 2.2 清腦膠囊含藥血清對(duì)PC12細(xì)胞缺氧損傷的影響
　　 2.

16、2.1 MTT法測(cè)定各組細(xì)胞增殖活性與空白血清對(duì)照組相比，模型組OD值顯著降低(P＜0.01)；與模型組相比，5％含藥血清中、高劑量組OD值顯著升高(P＜0.01)，5％含藥血清低劑量組OD值有升高趨勢(shì)但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.2.2 LDH活力測(cè)定與空白血清對(duì)照組相比，模型組LDH漏出量顯著升高(P＜0.01)；與模型組相比，5％含藥血清中、高劑量組LDH漏出量顯著降低(P＜0.01)，抑制率分別為40.5％