補(bǔ)腎中藥單體對(duì)mESC自我更新和分化的影響及機(jī)制研究.pdf

1、課題組研究發(fā)現(xiàn)，腎精具有干細(xì)胞的內(nèi)涵。本項(xiàng)目選取臨床常用的四種代表性補(bǔ)腎藥物淫羊藿、補(bǔ)骨脂、女貞子、何首烏的有效單體為研究對(duì)象，以柴胡的有效單體為非補(bǔ)腎藥物對(duì)照，并以文獻(xiàn)報(bào)道的誘導(dǎo)分化藥維甲酸(RA)為陽(yáng)性對(duì)照，觀察其對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞(mESC)自我更新及不同胚層的分化的影響，并進(jìn)行初步的分子機(jī)制探索。本項(xiàng)目從藥物效應(yīng)角度為“腎藏精與干細(xì)胞的關(guān)系”的命題提供部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的:
　　1觀察補(bǔ)腎中藥單體淫羊藿苷(ICA)

2、、補(bǔ)骨脂素(Pso)、齊墩果酸(OA)、二苯乙烯苷(THSG)對(duì)mESC自我更新和分化的影響。
　　2探索上述中藥單體對(duì)mESC作用的分子機(jī)制。
　　方法:
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)、分組及藥物干預(yù):取對(duì)數(shù)期的mESC懸滴3天形成擬胚體后再懸浮培養(yǎng)2天，在第6天貼壁時(shí)加入中藥單體進(jìn)行干預(yù)。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、溶劑對(duì)照組(DMSO)、分化陽(yáng)性對(duì)照組(RA)、補(bǔ)腎中藥單體組(ICA、THSG、Pso、OA)及非補(bǔ)腎中藥單體組（柴胡

3、皂苷Sai），每組均設(shè)高、中、低3個(gè)濃度梯度。
　　2.Alamar染色檢測(cè)藥物對(duì)mESC生長(zhǎng)曲線和早期增殖的影響:取對(duì)數(shù)期mESC接種于96孔板，加入不同濃度的中藥單體，Alamar檢測(cè)不同時(shí)點(diǎn)的OD值。
　　3.堿性磷酸酶(AP)染色檢測(cè)補(bǔ)腎中藥單體對(duì)mESC克隆效率的影響:取對(duì)數(shù)期mESC接種于96孔板，加入不同濃度的中藥單體，AP染色，并在顯微鏡下分類計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)為每個(gè)克隆藍(lán)紫色染色面積大于該克隆總面積的90％為未

4、分化克隆，小于總面積20％為分化克隆，其余為混合型克隆。
　　4.干性維持基因及不同胚層標(biāo)志物的檢測(cè):采用RT-PCR、qPCR及蛋白印跡檢測(cè)mESC干性維持基因Oct3/4、Nanog、 Sox2，內(nèi)胚層標(biāo)志物Sox17，中胚層Brachyury、 Nkx2.5和外胚層標(biāo)志物Pax6。
　　5.mESC調(diào)控相關(guān)LIF通路關(guān)鍵分子的檢測(cè):采用RT-PCR、蛋白印跡檢測(cè)LIF信號(hào)通路的主要分子ERK1、C-fos、p38MAP

5、K、C-jun、gp130、Stat3、JAK1、ERK5的水平。
　　結(jié)果:
　　我們首先觀察到分化陽(yáng)性對(duì)照藥RA能顯著抑制mESC早期增殖，降低未分化克隆數(shù)目并顯著降低mESC干性轉(zhuǎn)錄因子Oct3/4、Nanog、Sox2表達(dá)，升高胚層分化標(biāo)志物Brachyury、Pax6的表達(dá)，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致，表明本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)穩(wěn)定可靠。
　　1.補(bǔ)腎藥有效成份ICA、THSG、Pso及OA對(duì)mESC自我更新及胚層分化的影響:<

6、br>　　1) ICA能顯著促進(jìn)mESC克隆分化;顯著降低Oct3/4表達(dá)，升高Sox17、Brachyury及Nkx2.5表達(dá)。
　　2) THSG能顯著促進(jìn)mESC克隆分化;顯著降低Oct3/4表達(dá)，升高Sox17、Brachyury表達(dá)。
　　3) Pso能顯著促進(jìn)mESC克隆自我更新;顯著升高Oct3/4、Nanog、Sox2表達(dá)，降低Brachyury表達(dá)。
　　4) OA對(duì)mESC克隆數(shù)目及形態(tài)無(wú)顯著影響，

7、能降低Oct3/4 mRNA表達(dá)，但對(duì)Oct3/4蛋白表達(dá)無(wú)顯著影響;OA對(duì)各胚層標(biāo)志物表達(dá)均無(wú)顯著影響。
　　5)疏肝理氣藥主要成份Sai能促進(jìn)Pax6表達(dá)，但對(duì)mESC克隆數(shù)目及形態(tài)無(wú)顯著影響。
　　2.ICA、THSG、Pso對(duì)mESC調(diào)控相關(guān)LIF通路關(guān)鍵分子的影響
　　ICA顯著降低LIF上游分子JAK1、gp130表達(dá)，降低LIF下游轉(zhuǎn)錄因子stat3即其磷酸化水平;THSG顯著降低LIF上游分子JAK1表

8、達(dá)，降低下游分子gp130及轉(zhuǎn)錄因子stat3蛋白及其磷酸化水平;Pso顯著升高LIF下游stat3蛋白磷酸化水平。
　　結(jié)論
　　綜上所述，我們首次發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎藥主要成分ICA及THSG可能通過(guò)抑制gp130/stat3信號(hào)通路以促進(jìn)mESC早期向內(nèi)、中胚層分化;Pso則可能通過(guò)促進(jìn)stat3蛋白磷酸化以維持mESC干性。
　　本研究為“腎藏精具有干細(xì)胞內(nèi)涵”提供科學(xué)依據(jù)，并提示補(bǔ)腎藥物對(duì)于細(xì)胞具有不同的效應(yīng)和通路，為臨