大黃素等中藥單體對HT-29細(xì)胞TLR4表達(dá)及MAPKs信號通路的影響.pdf

1、潰瘍性結(jié)腸炎(UlcerativeColitis，UC)，又稱慢性非特異性潰瘍性結(jié)腸炎或特發(fā)性潰瘍性結(jié)腸炎，是一種原因不明的慢性腸道炎癥性疾病，與克隆氏病統(tǒng)稱炎癥性腸病(InflammatoryBowelDisease，IBD)。由于發(fā)病率呈上升趨勢，發(fā)病人群以青、壯年多見，成為嚴(yán)重影響健康的消化道疾病之一，因此，其發(fā)病機(jī)制和治療方法一直是全球醫(yī)學(xué)界的研究重點(diǎn)。 盡管IBD的發(fā)病機(jī)制不十分明了，但現(xiàn)有研究表明與遺傳、環(huán)境、感染及

2、免疫等多因素相關(guān)。近來，人們又關(guān)注到Toll樣受體(Toll-likereceptor，TLR)及多種細(xì)胞信號通道與IBD有關(guān)，本項目就是在研究UC的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)中藥有可能影響到這一環(huán)節(jié)，因此，選擇了大黃素等中藥單體對HT-29細(xì)胞TLR4表達(dá)及MAPKs信號通路的影響，嘗試進(jìn)一步探討IBD的病理機(jī)制和中藥的作用環(huán)節(jié)。 TLR最初是在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種負(fù)責(zé)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的跨膜受體，隨著研究的深入，根據(jù)其同源結(jié)構(gòu)域，人們發(fā)現(xiàn)在哺乳動物存

3、在著由多種Toll受體構(gòu)成的Toll受體家族(TLRs)，共有12種。TLRs是生物經(jīng)過數(shù)百萬年進(jìn)化后保留下來的宿主防御機(jī)制，通過對病原微生物的識別，直接啟動抗感染機(jī)制。目前，研究較為清楚的有TLR2和TLR4，分別識別肽聚糖和脂多糖等，激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，誘導(dǎo)細(xì)胞因子和防御素(Defensin)的表達(dá)，以及介導(dǎo)炎癥介質(zhì)的釋放等。 腸道粘膜上皮細(xì)胞也廣泛表達(dá)Toll受體，然而，正常情況下，腸道粘膜上皮細(xì)胞的TLR對腸道常駐微

4、生物及其產(chǎn)物呈低反應(yīng)狀態(tài)，這與其Toll受體蛋白的低表達(dá)和一些Toll信號通路負(fù)調(diào)控分子的高表達(dá)有關(guān)。然而，炎癥性腸病時，TLR的表達(dá)升高，引起NF-κB的活化而啟動防御機(jī)制，但過度激活NF-κB，會擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。 絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)是介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的重要信號系統(tǒng)，包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extracellular-signalregulatedprotei

5、nkinase，ERK)，c-Jun氨基未端激酶(c-Junamino-terminalkinase，JNK)/應(yīng)激激活蛋白激酶(Stress-activatedproteinknase，SAPK)、p38等MAPK亞族。通過高度保守的三級激酶級聯(lián)反應(yīng)的方式傳遞信號：細(xì)胞外刺激使MKKK(MAPkinasekinasekinase)激活，轉(zhuǎn)而激活MKK(MAPkinasekinase)，然后通過對蘇氨酸(Threonine，T)和酪氨酸

6、(Tyrossine，Y)的磷酸化激活MAPKs。MAPKs信號傳導(dǎo)通路的ERK1/ERK2、JNK/SAPK、p38MAPK參與IBD的腸粘膜損傷。 NF-κB是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，已知哺乳動物細(xì)胞的NF-κB蛋白家族包括NF-κB1、NF-κB2、RelA、RelB和c-Rel五個成員，它們以同源或異源二聚體的形式存在，通常NF-κB指p50/p65異二聚體。NF-κB被激活后入核內(nèi)發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，即與特定的κB序列結(jié)合

7、行使其功能，引起相應(yīng)靶基因的轉(zhuǎn)錄激活。NF-κB的過度活化可以引起多種疾病，在IBD中，NF-κB的活化使腸道粘膜上皮細(xì)胞分泌大量促炎因子，引起了粘膜上皮的損傷。 近年來，結(jié)合中醫(yī)藥治療本病療效顯著，對該病缺乏有效的治療手段起到了彌補(bǔ)作用，且無明顯不良反應(yīng)。作者在現(xiàn)有項目的實(shí)驗(yàn)研究中也發(fā)現(xiàn)，中藥或中藥成分確實(shí)能影響防御素的表達(dá)或產(chǎn)生，如大黃牡丹湯、大黃素、黃連素、辛弗林和黃芪甲苷等。而防御素的表達(dá)與TLR存在密切關(guān)系，所以，本研

8、究在原有研究基礎(chǔ)上，選用了大黃素等中藥單體，在對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響方面進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究。 本研究以HT-29細(xì)胞為研究對象，建立炎癥細(xì)胞模型，觀察不同狀態(tài)下HT-29細(xì)胞TLR4、MAPKs信號通路、NF-κB及IL-8分泌的變化，以及中藥對炎癥細(xì)胞模型的干預(yù)作用。 1實(shí)驗(yàn)研究 1.1細(xì)胞培養(yǎng)條件的建立 采用體外培養(yǎng)細(xì)胞的方法，研究了大黃素等中藥單體對細(xì)胞TLR4表達(dá)及MAPKs信號通路的影響，選用的細(xì)胞

9、為結(jié)腸腺上皮癌的HT-29細(xì)胞株，建立和穩(wěn)定了整個研究工作所需要的細(xì)胞培養(yǎng)條件。 主要對細(xì)胞傳代、細(xì)胞凍存和細(xì)胞復(fù)蘇條件進(jìn)行了優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上，通過顯微鏡觀察了細(xì)胞形態(tài)，采用了WST-8和MTT法測定了細(xì)胞增殖曲線。 結(jié)果顯示，HT-29細(xì)胞平鋪于培養(yǎng)瓶底面積超過瓶底80％時，即可傳代比例為1∶2；按5×106細(xì)胞加入凍存液1mL凍存；復(fù)蘇時，液氮罐中取出的細(xì)胞，于38℃迅速在1～2min內(nèi)解凍，細(xì)胞接種次日貼壁良好。增

10、殖曲線顯示，細(xì)胞以1×105/mL接種后3～4日生長旺盛，此時，細(xì)胞處于倍增期前后，適合實(shí)驗(yàn)。 1.2HT-29細(xì)胞生物學(xué)特性及中藥單體對其增殖的影響 首先觀察了中藥對HT-29細(xì)胞生長的影響，中藥單體大黃素、姜黃素、黃芪甲苷、梔子苷和柚皮苷等與HT-29細(xì)胞共培養(yǎng)12h和24h后，均未發(fā)現(xiàn)中藥影響細(xì)胞的增殖。大黃素與HT-29細(xì)胞共培養(yǎng)1周，亦未見其影響細(xì)胞的增殖。 以RT-PCR檢測HT-29細(xì)胞TLR4、M

11、D-2、IL-8基因表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)檢測其TLR4蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，HT-29細(xì)胞在無任何刺激劑的條件下，有TLR4、MD-2和IL-8mRNA的低表達(dá)，這是該細(xì)胞建立炎癥的基礎(chǔ)。大黃素、姜黃素和黃芪甲苷和梔子苷也不改變其表達(dá)量。但LPS刺激后，HT-29分泌IL-8的量能明顯升高，符合炎癥狀態(tài)下的表現(xiàn)，所以，可以考慮給細(xì)胞以LPS刺激建立炎癥細(xì)胞模型。 1.3炎癥細(xì)胞模型的建立和中藥的干預(yù)作用 通過RT-PCR法對T

12、LR4和MD2基因表達(dá)的觀察發(fā)現(xiàn)，κ-IFN可以明顯促進(jìn)他們的表達(dá)，符合炎癥細(xì)胞的特征，所以，也可用于炎癥細(xì)胞模型的建立。以IL-8分泌情況觀察，LPS與IFN有協(xié)同作用，說明可以用于炎癥細(xì)胞模型的制備。綜上所述，IFN、LPS和IFN+LPS均可用于HT-29炎癥細(xì)胞模型的制備。 中藥對炎癥性細(xì)胞模型干預(yù)作用的結(jié)果顯示，IFN使TLR4基因表達(dá)上調(diào)，黃芪甲苷和大黃素組能抑制IFN引起的這種上調(diào)作用；IFN使細(xì)胞的MD-2基因表

13、達(dá)上調(diào)，黃芪甲苷組、梔子苷和大黃素可抑制IFN的上調(diào)作用。IL-8的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷、梔子苷、大黃素和姜黃素均明顯降低由于LPS和IFN引起的IL-8分泌增加，以大黃素作用相對較強(qiáng)?？傮w來看，所選用的中藥單體，均有不同程度抑制HT-29細(xì)胞的炎性表現(xiàn)，考慮到大黃素作用較強(qiáng)，后續(xù)主要以大黃素為研究對象。 不同濃度大黃素對炎癥模型細(xì)胞分泌IL-8的影響結(jié)果表明，10μmol/L～80μmol/L的大黃素均能顯著降低IFN+LP

14、S所引起的HT-29細(xì)胞IL-8分泌，呈劑量依賴關(guān)系，進(jìn)一步驗(yàn)證了大黃素的作用。 1.4中藥對HT-29細(xì)胞MAPKs信號通路的干預(yù)作用 上述研究是從蛋白或多肽水平觀察大黃等中藥單體具有抑制模型炎癥反應(yīng)的作用，本實(shí)驗(yàn)通過對MAPKs信號通道系統(tǒng)中ERK/JNK/p38的檢測，了解大黃素是否通過此環(huán)節(jié)抑制炎癥模型細(xì)胞的炎癥過程。檢測結(jié)果顯示，LPS在10ng/mL、100ng/mL和1000ng/mL劑量時，可明顯使ERK

15、、JNK和p38等分子磷酸化增加，即細(xì)胞被活化或代謝旺盛，而且，LPS作用15min時最強(qiáng)，30min后開始有減弱的趨勢。此外，IFN可以促進(jìn)LPS的這種活化作用。所以，在觀察大黃素對MAPKs的作用時選擇LPS+IFN制備炎癥細(xì)胞模型。大黃素對炎癥細(xì)胞模型MAPK信號通道影響的研究結(jié)果提示，大黃素能明顯抑制炎癥細(xì)胞模型的JNK和p38磷酸化，也有抑制ERK的趨勢，說明大黃素可以影響MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。 1.5中藥對HT-2

16、9細(xì)胞NF-κB信號分子活性的影響 為了進(jìn)一步探討MAPK信號通路激活的機(jī)制，又對其下游分子NF-κB活性及含量進(jìn)行了檢測。由于NF-κB活化后不僅含量增加，而且，還會出現(xiàn)轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，即活化的NF-κB會穿過細(xì)胞的核膜，到達(dá)細(xì)胞核發(fā)揮其效應(yīng)。利用該特性，通過觀察轉(zhuǎn)位現(xiàn)象判斷NF-κB活化與否。結(jié)果表明，LPS和LPS+IFN均能使NF-κB明顯轉(zhuǎn)位，大黃素對HT-29炎癥細(xì)胞模型NF-κB的活化有明顯的抑制作用，并有劑量依賴關(guān)系。