大承氣湯及大黃素對大鼠腦出血的治療作用及對Nrf2-Src-MAPKs通路的影響.pdf

1、背景：
　　腦出血（Intracerebral hemorrhage，ICH）屬中醫(yī)“出血性中風”范疇。歷史上，通腑法治療中風淵源悠久，并曾經(jīng)廣為運用。在現(xiàn)代，以王永炎為代表的通腑化痰治療急性期中風的學派影響深遠。臨床中，ICH病人常發(fā)病即有大便不通(常持續(xù)3～5天，甚至10余天)等腑實之象。此時清者不升，濁者不降，氣機升降乖逆，中焦阻塞不通。腑不通則竅不開，熱不去必風不熄，平肝潛陽降逆諸法揚湯止沸緩不濟急，唯通腑瀉熱一途釜底抽薪

2、最為適宜。應用通腑法治療ICH時以大承氣湯最為常見，但其對ICH作用的現(xiàn)代醫(yī)學確切機制尚不很明了。
　　炎癥反應與氧化應激是ICH后腦損傷最重要的機制。其中，小膠質(zhì)細胞激活并獲得吞噬性，以清除血腫及腦組織和紅細胞壞死時產(chǎn)生的碎片。激活的小膠質(zhì)細胞也表達和釋放促炎性因子，從而加重腦損傷。對ICH后小膠質(zhì)細胞的激活究竟該抑制還是該促進的爭議在持續(xù)。另外，對于如何有效地判斷小膠質(zhì)細胞是否激活及其程度，以及其形態(tài)、功能改變有否未盡知之規(guī)律

3、等等問題，都值得學界研究。
　　在ICH后氧化應激和炎癥反應中，Nrf2/Src/MAPKs通路被激活，并對ICH產(chǎn)生影響。那么，大承氣湯及大黃素對此是否也有影響？影響如何？闡明這個問題勢必將對大承氣湯及大黃素作用機制做出深刻揭示。
　　目的：
　　對膠原酶VII誘導ICH模型大鼠給予大承氣湯及大黃素灌胃治療，研究大承氣湯及大黃素對ICH的治療作用，及對Nrf2/Src/MAPKs通路的影響及效應，并對ICH后小膠質(zhì)細

4、胞激活特點、規(guī)律進行探討。
　　方法：本實驗對膠原酶VII誘導ICH模型大鼠給予大承氣湯及大黃素灌胃治療，采用組織化學、行為學檢測、MRI、免疫組化、多重免疫熒光標記、免疫印跡等技術手段對ICH模型大鼠進行觀察及評價。
　　ICH模型復制及其評價：對3月齡SD雄性大鼠腦左側CPU注射膠原酶VII0.4U，以復制ICH動物模型。通過MRI結構像、TTC染色、行為學實驗（平衡木實驗、懸體扭轉(zhuǎn)實驗）及一般情況觀察等方法來評價膠原酶

5、VII注射后3 d時模型制作效果。
　　大承氣湯、大黃素對ICH治療作用：對膠原酶VII注射大鼠給予大承氣湯及大黃素灌胃治療。觀察大鼠一般情況及體重改變，評估其整體疾病狀態(tài)及恢復程度；行為學實驗（平衡木實驗、懸體扭轉(zhuǎn)實驗）觀察ICH后大鼠一側肌力改變程度，評價其神經(jīng)功能缺損及恢復；MRI檢測血腫體積以評估ICH后腦組織受損范圍；普魯士藍染色評估ICH病理改變及恢復；MRI波譜檢測出血區(qū)域腦組織乳酸水平。
　　小膠質(zhì)細胞的激活

6、及其規(guī)律：免疫組化（Iba-1）觀察ICH后小膠質(zhì)細胞的激活及規(guī)律；免疫組化（IL-1β、IL-10）及多重免疫熒光標記觀察激活的小膠質(zhì)細胞分泌的細胞因子類型及水平；普魯士藍染色觀察ICH后小膠質(zhì)細胞對鐵的吞噬及鐵沉積，以評價小膠質(zhì)細胞吞噬功能和鐵沉積病理改變。
　　大承氣湯、大黃素對ICH后Nrf2/Src/MAPKs通路的影響：免疫印跡觀察 Nrf2/Src通路的激活及其對下游 MAPKs（ERK、JNK、p38）的作用，以及

7、對促炎性因子（IL-1β、TNF-α）及抗炎性因子（Arg1、IL-10）表達水平的影響。
　　結果：
　　ICH模型成功復制膠原酶VII注射后3 d，大鼠一般狀況差，體重下降。TTC染色示造模后左側CPU局部組織結構被破壞。MRI結構像示造模后3 d時，左側CPU出現(xiàn)高信號區(qū)，提示出血。行為學實驗示造模后3 d時，大鼠因一側肌力減退而出現(xiàn)異常行為，表現(xiàn)為平衡能力、動作協(xié)調(diào)性下降，以及懸體搖擺時軀體扭轉(zhuǎn)偏向于出血側即左側。無

8、論是整體狀態(tài)，還是行為異常，均提示大鼠在膠原酶VII注射后3 d時出現(xiàn)類似ICH后的臨床表現(xiàn)，而MRI結構像及TTC染色則直接證實ICH的產(chǎn)生及腦組織結構的破壞。由此肯定，膠原酶VII誘導ICH模型成功。
　　大承氣湯、大黃素對ICH的治療作用行為學實驗結果表明大承氣湯、大黃素治療后大鼠一側肌力減退情況顯著改善；普魯士藍染色結果表明大承氣湯、大黃素治療后普魯士藍染色著色程度在ICH后14 d時達到峰值，并且其加重趨勢在28 d時得

9、到根本扭轉(zhuǎn)（此時模型組大鼠著色程度加重趨勢無改變）；MRI出血灶體積測定結果表明大承氣湯、大黃素的治療可以使ICH后出血灶體積減?。ㄅc模型組比較）；一般情況的觀察及體重增加表明大承氣湯、大黃素治療可以促進ICH后整體恢復。
　　ICH后小膠質(zhì)細胞的激活 Iba-1染色證明ICH后小膠質(zhì)細胞激活， Iba-1/GFAP雙標表明小膠質(zhì)細胞更接近于病變位置，提示ICH后小膠質(zhì)細胞的作用可能更早、更快及更重要。同時發(fā)現(xiàn)ICH后，小膠質(zhì)細胞

10、聚集于出血區(qū)域及其周圍，并在出血及周圍區(qū)域間形成條帶。對小膠質(zhì)細胞分支條數(shù)、胞體面積的分析發(fā)現(xiàn)兩者均與離出血中心區(qū)域的距離呈負相關。通過設計一種新的分析方法，即小膠質(zhì)細胞激活系數(shù)分析方法（MAF），我們能對ICH出血中心及其周圍連續(xù)區(qū)域腦組織的小膠質(zhì)細胞激活程度進行準確的定量測量。利用MAF，發(fā)現(xiàn)在ICH中心區(qū)域邊緣外400μm范圍內(nèi)，小膠質(zhì)細胞激活程度與其到出血中心區(qū)域邊緣的距離呈直線負相關。ICH后，激活的小膠質(zhì)細胞形態(tài)及功能均發(fā)生

11、明顯改變，且兩者大致相適應，提示小膠質(zhì)細胞形態(tài)及功能具有可塑性。
　　小膠質(zhì)細胞吞噬及分泌功能 Iba-1染色及Iba-1/普魯士藍雙重染色表明在ICH后，激活的小膠質(zhì)細胞對入腦的紅細胞，以及壞死的紅細胞和腦組織碎片進行吞噬。尤其是當小膠質(zhì)細胞在出血區(qū)域周圍密集形成條帶時，這種吞噬功能可以限制血腫擴大，以及鐵、血紅素等神經(jīng)毒性物質(zhì)的擴散。吞噬鐵后，小膠質(zhì)細胞會出現(xiàn)鐵過載，鐵過載的小膠質(zhì)細胞會出現(xiàn)特殊的細胞行為以實現(xiàn)鐵卸載。多重免疫

12、熒光標記證明ICH3 d時，出血中心區(qū)域周圍激活的小膠質(zhì)細胞主要是M1型，且分泌IL-1β，但幾乎不分泌TNF-α；在ICH后7 d以前，小膠質(zhì)細胞M1型激活占主導，而在7 d以后，M2型激活占主導。
　　Nrf2/Src/MAPKs通路的激活、效應及大承氣湯和大黃素的影響通過Western Blot檢測注射側CPU促/抗炎性因子表達水平，發(fā)現(xiàn)ICH后14 d時，大承氣湯和大黃素能下調(diào)促炎性因子IL-1β，但不能下調(diào)TNF-α；能

13、上調(diào)抗炎性因子Arg1和/或IL-10；通過檢測MAPKs水平，發(fā)現(xiàn)大承氣湯治療后P-ERK/ERK處于高水平，P-JNK/JNK處于低水平，而P-p38/p38水平無變化；大黃素干預后此三者均處于高水平。上述效應由N rf2/Src通路上調(diào)而引發(fā)，但在ICH后14 d時，Nrf2和/或Src呈低水平（其原因為p38對Nrf2的下調(diào)和促降解作用）。我們同時對注射側海馬作了觀察，發(fā)現(xiàn)大承氣湯、大黃素的治療可以上調(diào)抗炎性因子Arg1、IL-

14、10分泌水平，下調(diào)促炎性因子TNF-α水平，IL-1β水平無改變，并下調(diào)p38水平（vs Mod）。
　　結果歸納：
　　⑴ICH后，大承氣湯和大黃素的治療能加速行為異常的恢復（即改善神經(jīng)功能缺損）；減小出血灶體積（使更多腦組織受到保護而幸存）；使鐵沉積病理改變更早開始恢復（從而縮短ICH的病理進程）。
　?、仆ㄟ^Nrf2/Src信號通路的激活，大承氣湯和大黃素的治療可以上調(diào)抗炎性因子Arg1、IL-10（以促進ICH

15、后腦組織的修復及神經(jīng)功能的恢復）；抑制MAPKs（JNK）而下調(diào)促炎性因子IL-1β（以降低ICH后炎癥反應從而減少腦損傷）；Src還促進ICH后小膠質(zhì)細胞的遷移及吞噬（以限制血腫擴大，以及鐵等神經(jīng)毒性物質(zhì)的擴散，從而保護周圍腦組織）。
　　⑶激活的小膠質(zhì)細胞形態(tài)及功能均發(fā)生明顯改變。其吞噬功能可以限制ICH后血腫的擴大，以及鐵、血紅素等神經(jīng)毒性物質(zhì)的擴散（從而保護周圍腦組織）。
　　⑷MAF可以對ICH出血中心及其周圍連續(xù)

16、區(qū)域腦組織的小膠質(zhì)細胞激活程度進行準確的定量測量。⑸鐵過載的小膠質(zhì)細胞進行鐵卸載時出現(xiàn)特殊的細胞行為。
　　結論：
　?、糯蟪袣鉁痛簏S素的治療對ICH大鼠具有保護及促進恢復的作用；
　　⑵該作用是經(jīng)由Nrf2/Src/MAPKs信號通路而實現(xiàn)；
　?、羌せ畹男∧z質(zhì)細胞具有形態(tài)及功能可塑性，且形態(tài)與功能相適應；
　?、燃せ畹男∧z質(zhì)細胞吞噬功能可以保護周圍腦組織；
　　⑸MAF以定量的方式準確判斷小膠質(zhì)