高壓氧對大鼠腦出血后腦消腫的影響及機理研究.pdf

1、第一部分高壓氧治療對大鼠急性腦出血后腦水腫的影響
　　目的：
　　研究高壓氧治療對大鼠急性腦出血后腦水腫的影響及高壓氧治療對鐵離子和凝血酶所致腦水腫的影響。
　　方法：
　　本實驗采用雄性SD大鼠，共60只，體重300～350g，由復(fù)旦大學(xué)實驗動物科學(xué)部提供。實驗中高壓氧治療(HBO治療)方案采用3.0標準大氣壓維持1h(加壓時間為15min，減壓時間為25～30min)。對照組假治療方案采用1.0標準大氣壓的空

2、氣中維持1h。
　　實驗分為三個部分：
　　1.12只大鼠基底節(jié)內(nèi)立體定向注射100μl自體股動脈血制成腦出血模型，模型制作1h后大鼠接受HBO治療一次(HBO組，n=6)或者假治療一次(對照組，n=6)，腦出血模型制作24h后大鼠斷頭取腦，采用干濕重法測定腦組織水含量，另取12只大鼠基底節(jié)內(nèi)立體定向注射100μl自體股動脈血制成腦出血模型，于腦出血模型制作后1h后給予HBO治療，24h和48h后分別再給予一次HBO治療(H

3、BO組，n=6)，對照組大鼠(n=6)分別在對應(yīng)時間點給予假治療，兩組大鼠均于腦出血模型制作72h后斷頭取腦，采用干濕重法測定腦組織水含量。
　　2.12只大鼠基底節(jié)內(nèi)立體定向注射鼠凝血酶(5U/50μl生理鹽水)1h后接受HBO治療一次(HBO組，n=6)或者假治療一次(對照組，n=6)，24h后大鼠斷頭取腦，采用干濕重法測定腦組織水含量值。另12只大鼠基底節(jié)內(nèi)立體定向注射FeCl2(1mM，50ul)1h后接受HBO治療一次(

4、HBO組，n=6)或者假治療一次(對照組，n=6)，24h后斷頭取腦，采用干濕重法測定腦組織水含量。
　　3.6只大鼠基底節(jié)內(nèi)立體定向注射100μl自體股動脈全血制成腦出血模型1h后接受HBO治療一次(HBO組，n=3)或者假治療一次(對照組，n=3)，腦出血模型制作24h后處死大鼠，取血腫周圍組織勻漿后采用Westernblot法檢測HO-1蛋白的表達情況。另6只大鼠基底節(jié)內(nèi)立體定向注射100ul自體股動脈全血制成腦出血模型1h

5、后接受HBO治療一次(HBO組，n=3)或者假治療一次(對照組，n=3)，腦出血模型制作24h后處死大鼠，取腦組織切片后行HO-1的免疫組織化學(xué)染色。實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析采用Stata7.0統(tǒng)計軟件進行，腦組織水含量數(shù)據(jù)和Western blot檢測所得蛋白條帶灰度像素值采用均數(shù)±標準差(x±s)表示，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，兩組之間均數(shù)對比采用完全隨機成組設(shè)計資料的t檢驗。
　　結(jié)果：
　　1.基底節(jié)腦出血1h

6、后給予單次HBO治療組大鼠右側(cè)(血腫側(cè))基底節(jié)組織水含量為80.1±1.3％，顯著低于對照組(81.4±1.1％，P<0.05)。
　　2.基底節(jié)腦出血后連續(xù)三天每天一次HBO治療組和對照組大鼠右側(cè)(血腫側(cè))基底節(jié)組織水含量分別為81.8±0.7％和82.6±0.8％，兩組間無顯著性差異(P>0.05)。
　　3.基底節(jié)內(nèi)注射凝血酶(5U/50ul生理鹽水)1h后給予單次HBO治療組大鼠和對照組大鼠右側(cè)(注射凝血酶側(cè))基底節(jié)

7、組織水含量分別為84.5±1.0％和84.6±1.4％，兩組間無顯著性差異(P>0.05)。
　　4.基底節(jié)內(nèi)注射鐵離子(Fecl21mM，50μl)24h后，后給予單次HBO治療組大鼠右側(cè)(注射鐵離子側(cè))基底節(jié)組織與皮層組織水含量分別為84.9±0.9％和82.8±1.0％，均顯著高于對照組大鼠右側(cè)(注射鐵離子側(cè))基底節(jié)組織與皮層組織水含量(分別為82.1±1.9％和81.2±0.7％，P<0.05)。
　　5.Weste

8、rn blot檢測顯示大鼠基底節(jié)腦出血后給予單次HBO治療組大鼠血腫周圍基底節(jié)組織內(nèi)HO-1蛋白水平顯著高于對照組(P<0.05)，免疫組化染色顯示HBO組大鼠基底節(jié)組織內(nèi)HO-1免疫活性細胞明顯少于對照組。
　　結(jié)論：
　　1.腦出血后1h給予單次HBO治療顯著減輕大鼠腦出血24h后腦水腫。單次HBO治療不能顯著減輕凝血酶所致腦水腫且顯著加重鐵離子所致腦水腫。提示單次HBO治療減輕腦出血后24h后腦水腫并非通過減輕凝血酶和

9、鐵離子所致腦水腫起作用的。腦出血后單次HBO治療減輕腦出血后血腫周圍組織內(nèi)HO-1蛋白水平，這可能與腦出血后單次HBO治療減輕腦出血24h后腦水腫相關(guān)。
　　2.腦出血后每天一次連續(xù)三天HBO治療既未能顯著減輕也未能顯著加重腦出血后72h腦水腫，表明腦出血后急性期給予HBO治療對腦出血后腦水腫無顯著影響，可能與出血后二至三天內(nèi)血腫釋放鐵離子等血紅蛋白降解產(chǎn)物，而HBO治療顯著加重了鐵離子所致腦水腫有關(guān)，本研究提示腦出血后急性期不宜

10、進行HBO治療。
　　第二部分高壓氧預(yù)處理對大鼠急性腦出血后腦水腫的影響
　　目的：
　　研究高壓氧預(yù)處理對大鼠急性腦出血后腦水腫的影響。
　　方法：
　　本實驗采用雄性SD大鼠，共78只，體重300～350g，由復(fù)旦大學(xué)實驗動物科學(xué)部提供。實驗中高壓氧預(yù)處理(HBOP)方案為采用3.0標準大氣壓維持1h(加壓時間為15min，減壓時間為25～30min)。假處理方案采用1.0標準大氣壓的空氣中維持1h。<

11、br>　　實驗分為四個部分：
　　1.36只大鼠接受連續(xù)兩天(HBOP2d組，n=6)或者三天(HBOP3d組，n=6)或者五天(HBOP5d組，n=6)HBOP，或者接受接受連續(xù)兩天(對照組2d組，n=6)或者三天(對照組3d組，n=6)或者五天(對照組5d組，n=6)假處理，最后一次預(yù)處理24h后，采用基底節(jié)內(nèi)立體定向注射自體股動脈血100μl制成腦出血模型，模型制作24h后斷頭取腦，采用干濕重法測定腦組織水含量。另12只大鼠

12、接受連續(xù)五天HBOP(HBOP組，n=6)，或者連續(xù)五天假處理(對照組，n=6)，最后一次預(yù)處理24h后，采用基底節(jié)內(nèi)立體定向注射自體股動脈血100μl制成腦出血模型，模型制作72h后斷頭取腦，采用干濕重法測定腦組織水含量。
　　2.6只大鼠接受連續(xù)五天HBOP(HBOP組，n=3)或者接受五天假處理(對照組，n=3)，于最后一次預(yù)處理24h后處死大鼠，取基底節(jié)腦組織行Western blot檢測P44/42 MAPK、p70S6

13、K、HO-1蛋白的表達情況。另取6只大鼠接受連續(xù)五天HBOP(HBOP組，n=3)或者受五天假處理(對照組，n=3)，于最后一次預(yù)處理24h后處死大鼠，取基底節(jié)腦組織病理切片后行P44/42 MAPK、p70S6K、HO-1的免疫組織化學(xué)染色。
　　3.12只大鼠基底節(jié)內(nèi)立體定向注射5nmol P44/42 MAPK的抑制劑一PD098059(PD098059組，n=6)或者50μl PD098059的載體溶劑一4％DMSO(對照

14、組，n=6)后接受連續(xù)五天HBOP，最后一次預(yù)處理24h后，采用基底節(jié)內(nèi)立體定向注射100μl自體股動脈血制成腦出血模型，模型制作24h后斷頭取腦，采用干濕重法測定腦組織水含量。
　　4.6只大鼠接受連續(xù)五天HBOP(HBOP組，n=3)或者連續(xù)五天假處理(對照組，n=3)，最后一次預(yù)處理24h后，采用基底節(jié)內(nèi)立體定向注射自體股動脈血100μl制成腦出血模型，模型制作72h后處死大鼠，取腦組織行HE染色，光鏡下觀察血腫周圍組織炎癥

15、反應(yīng)情況，另取切片行TUNEL法免疫組化染色，鏡下觀察血腫周圍神經(jīng)細胞凋亡情況。
　　實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析采用Stata7.0統(tǒng)計軟件進行，腦組織水含量數(shù)據(jù)和Western blot檢測所得蛋白條帶灰度像素值采用均數(shù)±標準差(x±s)表示，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，兩組之間均數(shù)對比采用完全隨機成組設(shè)計資料的t檢驗。
　　結(jié)果：
　　1.連續(xù)兩天、三天HBOP組大鼠腦出血24h后右側(cè)(血腫側(cè))基底節(jié)組織水含量分

16、別為81.0±1.2％和80.6±1.2％，對照組分別為81.3±1.1％和81.2±0.2％，兩組間水含量數(shù)值均無顯著性差異(P>0.05)。
　　2.連續(xù)五天HBOP組大鼠腦出血24h與72h后右側(cè)(血腫側(cè))基底節(jié)組織水含量分別為79.5±0.9％和81.6±0.7％均顯著低于對照組(分別為81.2±1.2％和82.8±0.9％，P<0.05)。
　　3.Westernblot檢測顯示大鼠基底節(jié)腦出血后給予單次HBO治療

17、組大鼠血腫周圍基底節(jié)組織內(nèi)P44/42 MAPK、p70S6K、HO-1蛋白水平蛋白水平顯著高于對照組(P<0.05)，免疫組化染色顯示HBO組大鼠基底節(jié)組織內(nèi)P44/42 MAPK、p70S6K、HO-1蛋白水平免疫活性細胞明顯少于對照組。
　　4.PD098059組大鼠血腫側(cè)基底節(jié)組織腦組織水含量為80.8±1.1％顯著高于對照組(79.6±0.5％，P<0.05)。
　　5.HBOP組大鼠血腫周圍炎癥細胞浸潤程度顯著輕

18、于對照組，血腫周圍凋亡細胞顯著少于對照組。
　　結(jié)論：
　　1.連續(xù)二天、三天HBOP未能顯著減輕大鼠腦出血24h后腦水腫，連續(xù)五天HBOP顯著減輕大鼠腦出血后腦水腫
　　2.連續(xù)五天HBOP顯著上調(diào)大鼠基底節(jié)組織內(nèi)P44/42 MAPK、p70 S6K、HO-1蛋白水平。
　　3.P44/42 MAPK抑制劑-PD098059抵消了HBOP誘導(dǎo)的減輕腦出血后腦水腫的效應(yīng)，表明P44/42 MAPK細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途