人支持細(xì)胞和精原干細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)及其增殖機(jī)制的研究.pdf

1、背景與目的：
　　精子發(fā)生是精原干細(xì)胞自我更新與分化為精子的精細(xì)和復(fù)雜過(guò)程。支持細(xì)胞是精子發(fā)生微環(huán)境的重要組成部分，為精子發(fā)生提供結(jié)構(gòu)、營(yíng)養(yǎng)和免疫支持。精原干細(xì)胞可以通過(guò)有絲分裂和減數(shù)分裂分化為精子細(xì)胞。最近研究表明，精原干細(xì)胞可以去分化生成胚胎樣干細(xì)胞或轉(zhuǎn)分化為其他多種組織的細(xì)胞；支持細(xì)胞可以重編程成為神經(jīng)干細(xì)胞。因此，精原干細(xì)胞和支持細(xì)胞在生殖醫(yī)學(xué)和再生醫(yī)學(xué)中均具有重要的研究意義和應(yīng)用前景。但是由于人睪丸組織的獲取十分困難，關(guān)

2、于人類(lèi)支持細(xì)胞和精原干細(xì)胞的相關(guān)研究相對(duì)有限。傳統(tǒng)觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為，支持細(xì)胞為終末分化細(xì)胞，它們?cè)隗w外不能增殖。精原干細(xì)胞在睪丸組織中數(shù)量非常少，目前尚未建立其長(zhǎng)期的體外培養(yǎng)體系。因此對(duì)人支持細(xì)胞和精原干細(xì)胞進(jìn)行分離、鑒定、長(zhǎng)期培養(yǎng)并探索其增殖機(jī)制的研究十分必要。本研究通過(guò)從精子發(fā)生過(guò)程正常的梗阻性無(wú)精子癥患者的睪丸組織中分離人支持細(xì)胞和精原干細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行鑒定、長(zhǎng)期培養(yǎng)和相關(guān)增殖信號(hào)通路的檢測(cè)，旨在為人支持細(xì)胞和精原干細(xì)胞的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)

3、用提供細(xì)胞來(lái)源，并為它們的增殖機(jī)理提供新的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　第一部分人支持細(xì)胞分離、鑒定、長(zhǎng)期培養(yǎng)及其增殖機(jī)制的研究
　　目的：對(duì)人支持細(xì)胞進(jìn)行分離、鑒定和長(zhǎng)期培養(yǎng)，并探索其培養(yǎng)后的基因組穩(wěn)定性和增殖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　方法：兩步酶消化和差速貼壁的方法分離人支持細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行鑒定和長(zhǎng)期培養(yǎng)，通過(guò)微陣列（基因芯片）、RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)與Western Blots等技術(shù)，比較培養(yǎng)第1代、第5代和第10代人支持細(xì)

4、胞基因與蛋白的差異表達(dá)。
　　結(jié)果：通過(guò)對(duì)人支持細(xì)胞進(jìn)行分離、鑒定和長(zhǎng)期培養(yǎng)并對(duì)不同培養(yǎng)代數(shù)的支持細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、生化表型以及AKT和SMAD1/5磷酸化比較，得到以下結(jié)果：（1）兩步酶消化聯(lián)合差速貼壁的方法可以獲得高純度和高活性的人支持細(xì)胞。（2）在體外對(duì)人支持細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng)至2個(gè)月，可大量擴(kuò)增人支持細(xì)胞。（3）長(zhǎng)期培養(yǎng)的支持細(xì)胞的大規(guī)?；蜃V和重要蛋白如 GDNF、SCF和BMP4等穩(wěn)定表達(dá)，同時(shí) AKT和SMAD1/5等信號(hào)

5、通路持續(xù)被激活。
　　結(jié)論：人支持細(xì)胞可在體外成功進(jìn)行分離、長(zhǎng)期培養(yǎng)擴(kuò)增獲得大量的細(xì)胞，并維持穩(wěn)定的基因與蛋白表達(dá)。AKT和SMAD1/5信號(hào)通路參與人支持細(xì)胞增殖的調(diào)控。本研究可為人支持細(xì)胞在基礎(chǔ)研究和臨床的應(yīng)用提供大量的細(xì)胞來(lái)源，為支持細(xì)胞的增殖機(jī)制提供信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　第二部分人精原干細(xì)胞分離、鑒定、長(zhǎng)期培養(yǎng)及其增殖機(jī)制的研究
　　目的：分離和鑒定人精原干細(xì)胞，建立精原干細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)體系并探索其自我更新機(jī)制。<

6、br>　　方法：通過(guò)兩步酶消化聯(lián)合差速貼壁和免疫磁珠分選的方法從人睪丸組織分離得到 GPR125+的精原細(xì)胞，并進(jìn)行鑒定、長(zhǎng)期培養(yǎng)和信號(hào)通路的檢測(cè)。
　　結(jié)果：（1）兩步酶消化、差速貼壁和免疫磁珠分選方法可以分離得到高純度和高活性的人 GPR125+精原細(xì)胞。（2）使用水凝膠和添加多種生長(zhǎng)因子及添加物對(duì)人 GPR125+精原細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞能夠增殖并形成細(xì)胞克隆，細(xì)胞可培養(yǎng)二個(gè)月。（3）長(zhǎng)期培養(yǎng)后的細(xì)胞仍然保持了人精原干細(xì)胞的生