尼羅羅非魚(yú)精巢支持細(xì)胞、精原干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及添加物對(duì)其生長(zhǎng)增殖的影響.pdf

1、實(shí)驗(yàn)一 目的：分離培養(yǎng)尼羅羅非魚(yú)精巢支持細(xì)胞(Sertoli Cells，SCs)，探討不同添加物對(duì)尼羅羅非魚(yú)精巢支持細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響。 方法：無(wú)菌取發(fā)育至第III期的尼羅羅非魚(yú)精巢，PBS清洗后，剪碎精巢組織，0.25％胰蛋白酶消化，用含10％犢牛血清(new bovine serum，NBS)的L-15培養(yǎng)液終止消化，過(guò)濾，離心，獲得細(xì)胞。用含10％NBS的L-15培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞后，將細(xì)胞培養(yǎng)在鋪有明膠的培養(yǎng)瓶中，

2、并依據(jù)SCs比生殖細(xì)胞貼壁速度快的特性，篩選SCs。在26℃、無(wú)CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中，用含10％NBS的L-15培養(yǎng)液培養(yǎng)SCs。甲基綠染色。倒置顯微鏡下，觀察SCs的形態(tài)。生長(zhǎng)良好的SCs培養(yǎng)在96孔板中，分別采用含10％NBS的L-15、M199、F12培養(yǎng)液，含5％、10％、15％NBS的L-15培養(yǎng)液，含1％羅非魚(yú)血清的L-15+10％NBS培養(yǎng)液培養(yǎng)尼羅羅非魚(yú)SCs。各組每2d取6孔細(xì)胞，血球計(jì)數(shù)板計(jì)細(xì)胞數(shù)，繪制SCs生

3、長(zhǎng)曲線。 結(jié)果：胰蛋白酶消化分離精巢組織，L-15+10％NBS培養(yǎng)液培養(yǎng)，獲得尼羅羅非魚(yú)SCs。培養(yǎng)1～2d，SCs開(kāi)始貼壁并極化；培養(yǎng)3～5d，細(xì)胞完全貼壁并迅速增殖。開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)時(shí)，SCs呈長(zhǎng)柱狀或三角形。單個(gè)SCs呈不規(guī)則多邊形，核位于胞質(zhì)中央，呈卵圓形，胞質(zhì)中可見(jiàn)吞噬顆粒和空泡，空泡聚集于支持細(xì)胞胞質(zhì)的兩極或散布于核的四周。SCs在L-15培養(yǎng)液中貼壁生長(zhǎng)，在F12、M199培養(yǎng)基中較難貼壁。與F12、M199培養(yǎng)液相

4、比，L-15培養(yǎng)液更有助于尼羅羅非魚(yú)SCs生長(zhǎng)增殖(P<0.01)。與添加5％NBS、15％NBS相比，在L-15培養(yǎng)中添加10％NBS更有助于尼羅羅非魚(yú)SCs生長(zhǎng)增殖(P<0.05)。與無(wú)尼羅羅非魚(yú)血清相比，在10NBS+L-15培養(yǎng)中添加1％尼羅羅非魚(yú)血清能顯著促進(jìn)SCs生長(zhǎng)增殖(P<0.05)。 結(jié)論：采用胰酶消化、10％NBS+L-15培養(yǎng)液培養(yǎng)，獲得尼羅羅非魚(yú)精巢支持細(xì)胞；采用10％NBS+1％羅非魚(yú)血清+L-15培養(yǎng)

5、液培養(yǎng)，能顯著促進(jìn)尼羅羅非魚(yú)精巢支持細(xì)胞生長(zhǎng)增殖。 實(shí)驗(yàn)二 目的：分離、培養(yǎng)、鑒定尼羅羅非魚(yú)精原干細(xì)胞(spermatogonial stemcells，SSCs)，探討不同添加物對(duì)尼羅羅非魚(yú)精原干細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響。 方法：無(wú)菌取發(fā)育第III期以內(nèi)的尼羅羅非魚(yú)精巢，PBS清洗后，剪碎精巢組織，0.5mg/L膠原酶消化30min后，未完全消化精巢組織塊用0.25％胰蛋白酶-EDTA繼續(xù)消化5min，用含10％NB

6、S的L-15培養(yǎng)液終止消化，離心，收集細(xì)胞。用含10％NBS的L-15培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，并依據(jù)SSCs比支持細(xì)胞貼壁速度慢的特性，篩選尼羅羅非魚(yú)SSCs。在26℃、無(wú)CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中，用含5％NBS+10ng/mlLIF+1％羅非魚(yú)血清的L-15培養(yǎng)液培養(yǎng)尼羅羅非魚(yú)SSCs。采用堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，AKP)染色和體外分化實(shí)驗(yàn)對(duì)分離培養(yǎng)的尼羅羅非魚(yú)SSCs進(jìn)行鑒定。在有支持細(xì)胞飼養(yǎng)層和無(wú)飼養(yǎng)層的條

7、件下，培養(yǎng)尼羅羅非魚(yú)SSCs，測(cè)定SSCs分裂指數(shù)。在有支持細(xì)胞飼養(yǎng)層的條件下，分別采用添加2％、5％、10％NBS的L-15培養(yǎng)液，添加1％、2％、3％羅非魚(yú)血清的L-15+5％NBS培養(yǎng)液，添加5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL白血病抑制因子(leukemia.inhibitor factor，LIF)的L-15+5％NBS+1％羅非魚(yú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)尼羅羅非魚(yú)SSCs，比較不同添加物對(duì)尼羅羅非魚(yú)SSCs生長(zhǎng)增殖的影響。

8、 結(jié)果：SSCs貼壁時(shí)間為1～3d，3d后細(xì)胞開(kāi)始分裂增殖。SSCs培養(yǎng)約10d可形成數(shù)十個(gè)SSCs克隆，AKP染色陽(yáng)性。在無(wú)支持細(xì)胞飼養(yǎng)層、培養(yǎng)液不添加LIF的條件下，長(zhǎng)期培養(yǎng)，少數(shù)SSCs可分化形成類神經(jīng)元樣細(xì)胞。在有支持細(xì)胞飼養(yǎng)層時(shí)，SSCs分裂指數(shù)明顯高于無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)的SSCs，支持細(xì)胞飼養(yǎng)層明顯促進(jìn)精原干細(xì)胞分裂增殖(P<0.01)。與添加2％、10％NBS相比，添加5％NBS能顯著促進(jìn)精原干細(xì)胞生長(zhǎng)增殖(P<0.01)。

9、添加1％、2％、3％尼羅羅非魚(yú)血清對(duì)SSCs沒(méi)有顯著的促生長(zhǎng)增殖作用。添加5ng/mL、10ng/mLLIF可促進(jìn)SSCs增殖，添加15ng/mLLIF則抑制SSCs增殖，添加10ng/mLLIF更有助于SSCs生長(zhǎng)增殖。 結(jié)論：采用膠原酶、胰蛋白酶-EDTA兩步消化，5％NBS+10ng/mL LIF+1％羅非魚(yú)血清+L-15培養(yǎng)液培養(yǎng)，獲得尼羅羅非魚(yú)精原干細(xì)胞；使用尼羅羅非魚(yú)精巢支持細(xì)胞作飼養(yǎng)層，5％NBS+10ng/mL