大鼠精原干細胞分離純化方法的探討.pdf

1、隨著社會經(jīng)濟發(fā)展,人類生活方式的改變,男性不育的發(fā)病率逐年升高。由于男性不育的發(fā)病機制和某些環(huán)節(jié)還不甚了解,男性不育的治療面臨著治療手段單一,治療效果欠佳的局面。目前,睪丸生精功能下降所致無精子癥尚無確切療效的治療方法。精原干細胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是精子形成的前體細胞,具有永生化和多能化潛能,在睪丸微循環(huán)中具有增殖分化能力?，F(xiàn)有資料證實SSCs移植于具有免疫豁免的異體睪丸內(nèi)仍可繼續(xù)分化。SS

2、Cs移植技術(shù)可以使睪丸性無精子癥患者產(chǎn)生精子并獲得生育能力,通過夫婦間常見的方式自然受孕,符合倫理學及傳統(tǒng)觀念,更易于患者接受。SSCs移植在治療男性不育過程中可適用于青春期前和青春期進行放化療的腫瘤患者。青春期或青春期前的男孩及青壯年男性的常見惡性腫瘤,例如:何杰金病、睪丸癌、白血病等,隨著現(xiàn)代診斷技術(shù)和外科手術(shù)、放療及化療等診療水平的日益提高,這些患者的長期生存甚至治愈成為可能。而這類患者在治療的過程中其睪丸生精功能受到嚴重損害?？?/p>

3、慮到這一點,可在治療前收集患者的SSCs并通過冷凍等方法保存起來,保存其生育能力。SSCs移植也適用于成年后才發(fā)現(xiàn)的雙側(cè)隱睪,其睪丸未下降到陰囊內(nèi)的患者。這類患者睪丸在高溫的持續(xù)作用下生精功能嚴重受損,臨床表現(xiàn)為嚴重的少弱精子癥,甚至無精子癥。
　　有研究表明,這類患者的睪丸中仍有對熱不敏感的SSCs和支持細胞,可利用SSCs培養(yǎng)及移植技術(shù)恢復睪丸生精功能。SSCs移植同時適用于嚴重的睪丸生精功能障礙患者等。近來,研究發(fā)現(xiàn)應用自體

4、干細胞(脂肪源性干細胞、皮膚源性干細胞等)可分化誘導為生殖干細胞后進行移植,通過夫婦間正常的方式受孕。
　　本研究目的:1.探討分離純化精原干細胞(SSCs)的方法。2.探索簡便實用的SSCs細胞培養(yǎng)方法,降低SSCs的培養(yǎng)成本。該研究作為自體成體干細胞(脂肪干細胞、皮膚干細胞等)移植入睪丸治療少、無精子癥系統(tǒng)研究的前期探索,將為后續(xù)研究提供寶貴經(jīng)驗,最終達到治愈睪丸性不育的目的。
　　材料與方法:1.實驗動物選取出生后10

5、天的健康SD雄性大鼠,體重19~25g,隨機分三組:第一組:①機械法+兩步酶法制備SSCs懸液;第二組:②機械法+兩步酶法+percoll分離法制備SSCs懸液;第三組:③機械法+兩步酶法+percoll分離法+差速貼壁法制備SSCs懸液。2.實驗方法:2.1、取出生后10天的SD大鼠,脫頸處死后無菌收集雙側(cè)睪丸,分別通過①機械法+兩步酶法制備SSCs懸液;②機械法+兩步酶法+percoll分離法制備SSCs懸液;③機械法+兩步酶法+p

6、ercoll分離法+差速貼壁法制備SSCs懸液。2.2、c-kit的表達檢測將獲得的單細胞懸液處理后加入兔抗鼠c-kit多克隆抗體,再加入山羊抗兔IgG-FITC熒光二抗,以PBS代替一抗作為對照,熒光顯微鏡下觀察c-kit的表達情況。2.3、α6-Integrin的表達檢測將純化后的細胞懸液處理后加入兔抗鼠α6-Integrin多克隆抗體,再滴加即用型生物素化山羊抗兔IgG二抗,漂洗后滴加SABC試劑,再次漂洗。滴加DAB顯色液,以三

7、蒸水終止染色反應,再分別經(jīng)乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察α6-Integrin的表達情況,用以PBS代替一抗作為對照。2.4、臺盼藍排斥試驗檢測將獲得的單細胞懸液,用血球記數(shù)板分別計數(shù)活細胞和死細胞,計算細胞活性率。2.5、精原細胞純度的流式細胞儀檢測將獲得的單細胞懸液固定,漂洗,再離心收集細胞。加入兔抗鼠c-Kit多克隆抗體,4℃過夜。PBS漂洗后加入山羊抗兔IgG-FITC熒光二抗,4℃避光孵育。PBS漂洗兩次,再

8、以PBS重懸細胞后進行流式細胞儀檢測。同時設(shè)立以PBS代替一抗的陰性對照,在進行流式細胞儀檢測時將相應的陰性對照消減為零,消除自發(fā)熒光背景。2.6、將獲得的單細胞懸液進行培養(yǎng)觀察,免疫組化鑒定,臺盼藍排斥試驗及流式細胞儀檢測后對結(jié)果進行比較分析。
　　結(jié)果：1、①機械法+兩步酶法制備SSCs懸液;②機械法+兩步酶法+percoll分離法制備SSCs懸液;③機械法+兩步酶法+percoll分離法+差速貼壁法制備SSCs懸液生長情況符

9、合SSCs。2、以c-kit受體作為SSCs的特異性標記物,行細胞免疫組化染色,結(jié)果細胞膜和核周胞質(zhì)強表達c-kit。以α6-Integrin受體作為SSCs的特異性標記物,行細胞免疫組化染色,結(jié)果細胞膜和胞質(zhì)表達α6-Integrin。兩者與之對應的對照均呈陰性。3、以臺盼藍排斥試驗檢測細胞活率:①機械法+兩步酶法細胞活率(93.26±1.06)％,②機械法+兩步酶法+percoll分離法3帶細胞活率(93.50±0.85)％,③機械

10、法+兩步酶法+percoll分離法+差速貼壁法3帶細胞活率(94.73±0.82)％;三種方法活率比較:三種方法所得SSCs活率無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。4、①機械法+兩步酶法制備SSCs懸液精原細胞陽性細胞百分率為(63.34±0.79)％。②機械法+兩步酶法+percoll分離法制備SSCs懸液精原細胞陽性細胞百分率為(74.98±0.26)％。③機械法+兩步酶法+percoll分離法+差速貼壁法分離純化SSCs精原細胞陽性細胞

11、百分率為(79.17±0.83)％。三種方法純度比較:三種方法間純度不同(P<0.05)。多重兩兩比較結(jié)果:三種方法兩兩之間純度不同(P<0.05):②法精原細胞陽性細胞百分率高于①法;③法精原細胞陽性細胞百分率高于②法;①,②,③法所得SSCs純度呈增高趨勢(P<0.05)。
　　結(jié)論:1.機械法,兩步酶法,差速貼壁法,percoll分離法在分離純化過程中對SSCs活率影響一致。2.機械法+兩步酶法能夠分離出較高純度的SSCs,