間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體通過抑制BACH1促進(jìn)HO--1影響椎間盤退變的機(jī)制研究.pdf

1、下腰痛(Low Back Pain，LBP)在臨床上較為常見，是門診患者就診的常見病因之一[1]。下腰痛嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，并且給社會(huì)和個(gè)人造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。目前，如腰椎間盤突出癥、腰椎管狹窄癥及退變性側(cè)凸等，被公認(rèn)的是引起下腰痛主要疾病。通過大量的研究證實(shí)，這些疾病均與椎間盤退變(Intervertebral Disc Degeneration，IDD)及其繼發(fā)的病理改變有關(guān)[3]。下腰痛在中國(guó)的發(fā)病率逐年加劇，隨著社會(huì)老齡

2、化，腰椎退變性疾病患者亦呈遞增趨勢(shì)。目前在臨床上，針對(duì)椎間盤疾病，最主要的治療手段仍然是手術(shù)治療[4]。手術(shù)治療可以有效的緩解臨床癥狀，但是手術(shù)并不能從根本上修復(fù)已經(jīng)退變的椎間盤，并且有可能產(chǎn)生嚴(yán)重并發(fā)癥，給病人帶來更大的痛苦。因此對(duì)椎間盤退變機(jī)制及生物治療的深入研究具有十分重要現(xiàn)實(shí)意義。
　　椎間盤的解剖結(jié)構(gòu)分為，中央的髓核、外側(cè)的纖維環(huán)及上下兩端的終板構(gòu)成;椎間盤的主要功能為維持正常的脊柱結(jié)構(gòu)，承擔(dān)脊柱的生物應(yīng)力[5]。髓核組

3、織正常的含水量為椎間盤發(fā)揮生理功能、承擔(dān)應(yīng)力的必要前提，椎間盤退變?cè)缙诘挠跋駥W(xué)表現(xiàn)，即為MRI下T2加權(quán)像上髓核組織含水量減少，由高信號(hào)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榈托盘?hào)甚至無信號(hào)[6]。而含水量的減少，目前認(rèn)為是由于細(xì)胞外基質(zhì)的破環(huán)導(dǎo)致。含水量減少引起椎間高度降低，局部運(yùn)動(dòng)節(jié)段不穩(wěn)，最終導(dǎo)致髓核突出，神經(jīng)根管狹窄等病理變化從而壓迫局部神經(jīng)引起腰痛[7]。目前不少針對(duì)椎間盤退變的臨床研究都是根據(jù)其影像學(xué)上髓核含水量的變化來判斷椎間盤退變進(jìn)程的[8]，這也

4、是臨床工作中判斷椎間盤退變的重要指標(biāo)之一。
　　研究表明，椎間盤髓核細(xì)胞凋亡增加，炎癥因子的大量侵入，髓核中細(xì)胞外基質(zhì)(Extracelluar matrix，ECM)的代謝紊亂等是導(dǎo)致其發(fā)生退變的主要原因。大量研究結(jié)果證明，而在這些原因之中，髓核細(xì)胞外機(jī)制合成分解代謝紊亂被認(rèn)為是最主要的引起椎間盤退變的機(jī)制[9]。NP細(xì)胞在ECM代謝中起著關(guān)鍵作用，可分為兩個(gè)方面。關(guān)于合成代謝，ECM的主要成分是Ⅱ型膠原(COL-Ⅱ)和蛋白多糖

5、[10]。蛋白聚糖是必不可少的椎間盤的蛋白多糖的組成部分，與大量的硫酸化糖胺聚糖(sGAG)側(cè)鏈[11];這些分子使椎間盤具有凝膠特性，使其保持水分和機(jī)械支持能力。這些基質(zhì)基因在IDD的表達(dá)下降已被研究者報(bào)告，表明在IDD中合成代謝的減少[12，13]。在分解代謝方面，以往的研究表明基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和聚蛋白多糖酶(ADAMTS)在IDD中上調(diào)，這是IDD中ECM降解的主要原因。
　　近年來，再生醫(yī)學(xué)以及生物治療，成為研究

6、熱點(diǎn)[14]。對(duì)于椎間盤退變的生物治療和再生醫(yī)學(xué)的相關(guān)研究，也聚焦于具有修復(fù)及多向分化潛能的干細(xì)胞身上。該類治療方法通過注射等手段，將具有修復(fù)能力的干細(xì)胞直接作用于退變的椎間盤組織，促進(jìn)椎間盤內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的恢復(fù)以及基質(zhì)的再生，最終起到改善退變，甚至逆轉(zhuǎn)退變進(jìn)程的治療效果[15]。目前，針對(duì)椎間盤退變的再生治療手段，以間充質(zhì)干細(xì)胞為主。間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能、組織替代、調(diào)控微環(huán)境、影響局部免疫及炎癥反應(yīng)等特性，同時(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞來源多樣

7、，不同來源間多能性存在差異等特性。間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)的再生治療的研究非常廣泛，并且取得了很多積極的結(jié)果，然而間充質(zhì)干細(xì)胞治療存在來源獲取難、細(xì)胞易衰老、具有潛在致瘤性等弊端，極大地限制了間充質(zhì)干細(xì)胞的再生醫(yī)學(xué)研究及應(yīng)用。所以，基于干細(xì)胞治療的局限性，更多的研究者將目光投向間充質(zhì)干細(xì)胞所分泌產(chǎn)生的一種物質(zhì)——外泌體上。
　　外泌體是由細(xì)胞分泌的納米級(jí)囊泡，囊泡內(nèi)包含編碼RNA，非編碼RNA，蛋白質(zhì)，抗原遞呈因子，以及DNA[16,17

8、]。由于其具有雙層膜結(jié)構(gòu)，能夠很容易地穿透細(xì)胞膜達(dá)到將內(nèi)容物進(jìn)行細(xì)胞間轉(zhuǎn)導(dǎo)的效果，通過傳遞蛋白質(zhì)和RNA，外泌體可以調(diào)節(jié)受體細(xì)胞和其他器官的功能、活動(dòng)[18]。JCI也于2016年做?？瘜?duì)外泌體的發(fā)現(xiàn)、作用以及對(duì)未來應(yīng)用上的展望做了系統(tǒng)綜述。目前，外泌體的再生效應(yīng)，已經(jīng)在其他組織和器官損傷修復(fù)的研究中得到驗(yàn)證，包括心臟損傷治療、肺部損傷治療、肝臟再生治療、骨折愈合、腦卒中后再生治療等[19,20]。但是間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體能夠促進(jìn)椎間盤退

9、變的修復(fù)，其效果與干細(xì)胞治療相比優(yōu)勢(shì)如何等，目前仍在研究階段，僅有少量報(bào)道。因此本課題針對(duì)上述情況，擬對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體在椎間盤髓核細(xì)胞退變過程中的作用進(jìn)行系統(tǒng)研究，力求通過該研究發(fā)現(xiàn)治療椎間盤退變的新的手段，為今后的再生醫(yī)學(xué)相關(guān)治療研究打下基礎(chǔ)。
　　第一部分:間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的分離與鑒定
　　目的與方法:采集非開放性股骨骨折外傷患者股骨內(nèi)的新鮮骨髓標(biāo)本，按照Percoll密度梯度離心方法，分離和收集有核細(xì)胞，在5

10、％的CO2和37℃條件下，使用含15％胎牛血清的DMEN培養(yǎng)基靜止培養(yǎng)，細(xì)胞達(dá)90％融合時(shí)可以傳代。利用流式細(xì)胞術(shù)、以及誘導(dǎo)分化，鑒定干細(xì)胞特性。細(xì)胞傳代至P2代后，將間充質(zhì)干細(xì)胞接種于T75以上培養(yǎng)瓶中進(jìn)行擴(kuò)增，待細(xì)胞融合度達(dá)到90％時(shí)，更換低外泌體血清培養(yǎng)基，每2天換液收集培養(yǎng)基，連續(xù)收集，對(duì)收集到的培養(yǎng)基使用超速離心機(jī)多次離心，抽提外泌體。對(duì)收集到的外泌體，使用電鏡掃描及Nanosight分析外泌體的性狀，使用Western Bl

11、ot，檢測(cè)外泌體中特定的蛋白表達(dá)情況，使用融合試驗(yàn)明確外泌體的融合能力。
　　結(jié)果:成功培養(yǎng)出狀態(tài)良好的骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞7例。流式細(xì)胞試驗(yàn)測(cè)得CD29、CD90+、CD44+，CD105-、CD14-，CD34、CD45不表達(dá)等干細(xì)胞標(biāo)志物，證明所得細(xì)胞符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。將原代細(xì)胞進(jìn)行成骨及成脂誘導(dǎo)，原代細(xì)胞中顯示出明顯的鈣結(jié)節(jié)及脂肪滴，證明其多項(xiàng)分化潛能。細(xì)胞傳代至P2代后，用低外泌體血清培養(yǎng)基大量培養(yǎng)并收集上清，用超速離心法收

12、集抽提外泌體。用Western Blot方法檢測(cè)收集到的外泌體中CD81及CD63的表達(dá)情況，同時(shí)Nanosight及電鏡檢測(cè)外泌體的大小形態(tài)及純度，證明所收集得到的確定為純度較高的外泌體。將所得外泌體用PKH67染料染色并加入到MSC中，結(jié)果顯示外泌體可將MSC染色，證明其膜融合能力。
　　結(jié)論:完成骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)，并通過相關(guān)試驗(yàn)驗(yàn)證，所獲細(xì)胞符合間充質(zhì)干細(xì)胞國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。傳至P2代后，更換使用低外泌體血清培養(yǎng)基并收集，

13、用超速離心的方法抽提外泌體，并驗(yàn)證其確為外泌體。
　　第二部分:MSC外泌體對(duì)退變椎間盤的作用
　　目的與方法:根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，收集滿足條件的人髓核組織進(jìn)行原代培養(yǎng)。通過CCK-8增殖試驗(yàn)，驗(yàn)證所得外泌體是否存在細(xì)胞毒性，以及其促進(jìn)髓核細(xì)胞增殖能力。試驗(yàn)分組:設(shè)對(duì)照組為超速離心后的上清液作為去外泌體上清作組;設(shè)陰性對(duì)照組為HEK293細(xì)胞按照上述方法培養(yǎng)并收集上清進(jìn)行超速離心收集得到的外泌體;設(shè)空白對(duì)照組為超速離心后未培養(yǎng)過細(xì)

14、胞的原始培養(yǎng)基;設(shè)實(shí)驗(yàn)組為間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體組。
　　測(cè)定各樣本蛋白量，將不同濃度的樣品加入髓核細(xì)胞中，培養(yǎng)24h后，使用Western Blot、PCR以檢測(cè)處理后細(xì)胞外基質(zhì)分泌表達(dá)情況。同上述方法處理，驗(yàn)證與髓核細(xì)胞外基質(zhì)降解相關(guān)MMP、ADAMTS的表達(dá)情況，以及髓核細(xì)胞外基質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)情況。
　　使用高通量測(cè)序技術(shù)，找尋靶基因，分析外泌體對(duì)髓核細(xì)胞體外退變過程的影響。
　　結(jié)果:成功建立體外髓核細(xì)胞

15、系5株。通過增殖試驗(yàn)證明MSC外泌體對(duì)NP細(xì)胞不僅沒有細(xì)胞毒性，試驗(yàn)結(jié)果同時(shí)還證明MSC外泌體還具備提高髓核細(xì)胞增殖的能力。分組處理后，通過Western Blot、PCR等試驗(yàn)方法驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)組的髓核細(xì)胞較對(duì)照組及陰性對(duì)照組中，2型膠原、蛋白聚糖表達(dá)量顯著上調(diào)，分解代謝相關(guān)MMP1、MMP2、MMP7表達(dá)雖然沒有顯著下調(diào)，但是合成相關(guān)的ACAN、COLⅡ、CHSY表達(dá)顯著上調(diào)。高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，證明MSC外泌體處理后NP細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組水平基

16、因表達(dá)與對(duì)照組相比存在顯著差異。
　　結(jié)論:獲得正常人髓核細(xì)胞系5株。增殖試驗(yàn)證明MSC外泌體對(duì)NP細(xì)胞不具備細(xì)胞毒性，同時(shí)具有提高NP細(xì)胞增殖的能力。分組定量處理細(xì)胞，并使用Western Blot、PCR方法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體具有促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成，上調(diào)髓核細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)合成酶以及下調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)降解酶的表達(dá)。
　　第三部分:MSC外泌體上調(diào)HO-1影響椎間盤退變的機(jī)制研究
　　目的與方法:(1)根據(jù)高

17、通量RNA測(cè)序結(jié)果篩選候選靶基因。(2)結(jié)合MSC外泌體高通量miRNA測(cè)序數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)分析MSC外泌體中miRNA成分對(duì)靶基因的影響。(3)篩選與BACH1結(jié)合的、MSC外泌體處理后高表達(dá)的miRNA，并對(duì)結(jié)合進(jìn)行驗(yàn)證。(4)研究篩選出的miRNA對(duì)BACH1、HO-1表達(dá)的影響。(5)明確MSC外泌體通過microRNA對(duì)突變BACH1的結(jié)合位點(diǎn)的影響。
　　結(jié)果:(1)MSC外泌體處理后，NP細(xì)胞低氧相關(guān)基因表達(dá)存在

18、明顯差異。(2)MSC外泌體能夠顯著上HO-1表達(dá),而HO-1抑制性BACH1的表達(dá)則顯著下調(diào)。進(jìn)一步的miRNA測(cè)序數(shù)據(jù)顯示MSC來源外泌體中高峰度miRNA均與BACH1存在相互作用，提示其功能可能通過抑制BACH1來發(fā)揮。(3)通過miRNA實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)外泌體處理后的髓核細(xì)胞其BACH1抑制性miR-21、-23、-125、-let7均出現(xiàn)明顯上調(diào)。(4)利用miRNA模擬物進(jìn)行miRNA過表達(dá)，結(jié)果顯示上述候選miRN

19、A均能不同程度抑制BACH1表達(dá)。(5)MSC外泌體中miR-21、-23、-125、-let7能夠直接抑制BACH1的表達(dá)，促進(jìn)HO-1表達(dá)，影響椎間盤退變。
　　結(jié)論:證實(shí)MSC外泌體促進(jìn)IDD中ECM合成的作用，是通過miRNA等轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子來實(shí)現(xiàn)。證實(shí)對(duì)BACH1存在抑制性的miR-21、-23、-125、-let7，在MSC外泌體處理后上調(diào)，發(fā)現(xiàn)了外泌體上調(diào)HO-1的作用機(jī)制。
　　小結(jié)
　　本研究首次發(fā)現(xiàn)

20、了外泌體中所含有的BACH1靶向性miRNA因子能夠改善椎間盤退變。發(fā)現(xiàn)了miR-21、-23、-125、-let7在外泌體處理后的髓核細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)，而通過功能學(xué)驗(yàn)證明確了上述miRNA確實(shí)能夠引起B(yǎng)ACH1表達(dá)的變化，從而引起HO-1活性的增高，促進(jìn)椎間盤退變的修復(fù)。通過上述研究啟發(fā)了關(guān)于HO-1的調(diào)控機(jī)制。在前期針對(duì)HO-1修復(fù)椎間盤退變的基礎(chǔ)進(jìn)一步通過MSC來源外泌體豐富了HO-1的調(diào)控機(jī)制，此外也通過該研究進(jìn)一步證明了MS