病毒學(xué)研究方法簡介

1、病毒學(xué)研究方法簡介,生物安全實(shí)驗(yàn)室,P1實(shí)驗(yàn)室——研究的病毒危險(xiǎn)性較低，試驗(yàn)人員連口罩都不用帶，穿上白大褂就可以了，試驗(yàn)人員在這里很放松；P2實(shí)驗(yàn)室——研究的是中度危險(xiǎn)的病原，像肝炎、流行性感冒等等，要求戴防護(hù)性較好的口罩；P3實(shí)驗(yàn)室——研究的是高度危險(xiǎn)的病毒，傳染性很強(qiáng)，而且沒有疫苗，試驗(yàn)人員的保護(hù)措施要比P1/P2實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)密得多；P4實(shí)驗(yàn)室——全球級(jí)別最高的生物安全實(shí)驗(yàn)室，研究的是極度危險(xiǎn)的病毒，如令人談之色變的埃博拉病毒、馬

2、爾堡病毒，進(jìn)入這種實(shí)驗(yàn)室的工作人員，處于防護(hù)服的嚴(yán)密保護(hù)之下，連空氣都不能在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)呼吸，紅色螺旋狀管子，是專門用來向室內(nèi)輸送新鮮空氣的，試驗(yàn)人員一進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，要先屏住呼吸，馬上接上這種管子，然后才能呼吸。,,根據(jù)微生物及其毒素的危害程度不同，分為４級(jí)，一級(jí)最低，四級(jí)最高。,病毒學(xué)研究的主要方法,生物學(xué)特性測定:在宿主上的反應(yīng)——癥狀、傳播等病毒分離與培養(yǎng)：提純與純化、二元培養(yǎng)法光鏡與電鏡觀察：病毒粒子和病毒與相應(yīng)抗血清的特異免疫

3、吸附情況免疫學(xué)技術(shù)：以血清學(xué)和組織免疫化學(xué)方法檢測帶毒情況、多克隆抗體、單克隆抗體分子生物學(xué)技術(shù)：核酸分子雜交、PCR等,一、生物學(xué)特性測定,在宿主上的反應(yīng) 宿主范圍、癥狀表現(xiàn)、傳播方式等 病毒的理化性質(zhì) 病毒粒子的形態(tài)、大小、對(duì)理化因子的耐受性、 體外存活期等 病毒接種方法 注射接種、病毒組織培養(yǎng)技術(shù) 植物病毒——汁液摩擦接種、昆蟲介體接種、嫁 接接種、菟絲子接種法等,巨細(xì)胞病毒感染

4、細(xì)胞的典型“貓頭鷹眼”樣核內(nèi)包涵體,冠狀病毒感染——“非典”X線胸部檢查可見肺部不同程度的片狀陰影，少數(shù)病人進(jìn)展迅速，呈大片狀陰影，大多數(shù)為雙側(cè)改變，陰影吸收消散較慢。,TMV transmission by an Apis sp.,A severe mosaic symptom on tomato leaf (TMV),腿色斑Chlorotic spoting,黃化Yellowing,病毒檢測,二、病毒的分離與鑒定,,提純extra

5、ction/純化purification,病毒的分離與鑒定,病毒的提純是將宿主中的病毒粒子與宿主細(xì)胞組分區(qū)分開來的過程。 原理是利用病毒的蛋白質(zhì)和大分子粒體的特性，及其與宿主細(xì)胞組分在理化特性上的差異將病毒粒子區(qū)分出來，并盡可能保持侵染力。 目的是確切地研究病毒理化、生物學(xué)特性、化學(xué)組分、組成、增殖過程及機(jī)制，還可用于制備高效價(jià)的抗血清。,1953年，斯坦利第一次提取并結(jié)晶了 TMV，這是病毒學(xué)史上一個(gè)重要

6、的里程碑。,（一）病毒的純化與提純,,一般純化方法動(dòng)物病毒的純化：從空斑、病斑分離，用終點(diǎn)稀釋法植物病毒的純化：如確定是一種病毒，且可機(jī)械摩擦接種，則接種到適當(dāng)寄主上；如可能有多種病毒，則要嫁接傳染，先將病毒保存，然后試用蟲媒或其他方法分離。,二、病毒的分離與培養(yǎng),,,1、差速離心和密度梯度離心 差速離心：交替使用高速和低速離心高速離心（40000~80000g）使病毒沉淀，取沉淀低速離心（約4000g）僅去除大的細(xì)胞碎片

7、等雜質(zhì)，取上清 密度梯度離心：部分或完全根據(jù)顆粒在一個(gè)無對(duì)流介質(zhì)中的密度而獲得分離 蔗糖10%~40% CsCl等,（三）病毒提純的技術(shù),二、病毒的分離與培養(yǎng),,,2、沉淀法 簡便快速但粗糙易變性鹽析法 硫酸銨濃度達(dá)30~50%飽和度時(shí)多數(shù)病毒沉淀等電點(diǎn)沉淀 加醋酸或鹽酸丙酮沉淀 濃度達(dá)40~70%聚乙二醇沉淀 濃度達(dá)4~8%乙醇沉淀

8、 濃度達(dá)20% 沉淀植物蛋白，上清夜用硫酸 銨沉淀3、吸附法 磷酸鈣、離子交換樹脂、羧甲基纖維素4、酶處理 許多病毒抗蛋白酶和核酸酶,（三）病毒提純的技術(shù),二、病毒的分離與培養(yǎng),,,5、有機(jī)溶劑萃取有機(jī)溶劑可溶掉脂肪、有色雜質(zhì)或非病毒的變性蛋白，如脊髓灰質(zhì)炎病毒提純中用正丁醇：要考慮病毒對(duì)有機(jī)溶劑的耐受性,（三）病毒提純的技術(shù),

9、,,,脂肪,變性非病毒蛋白,病毒,水,醇,,,,,,二、病毒的分離與培養(yǎng),,,6、電泳法 普通電泳、密度梯度電泳、等電聚焦電泳等7、柱層析法 吸 附：用離子交換或吸附法 分子篩：瓊脂糖或葡聚糖制成凝膠柱8、抗血清處理 針對(duì)宿主蛋白的血清來沉淀雜蛋白 加病毒的抗血清形成病毒—抗體復(fù)合物,（三）病毒提純的技術(shù),二、病毒的分離與培養(yǎng),要證明某種疾病是某一感染因子所引

10、起．則必須滿足Rivers法則：① 從患病者體內(nèi)分離出病毒；② 在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或寄主細(xì)胞中可以培養(yǎng)；③ 證明這種培養(yǎng)物具有濾過性；④ 在原始宿主或相關(guān)種內(nèi)能產(chǎn)生同樣的病癥；⑤ 能重新分離出病毒。病毒的分離與鑒定組成了病毒學(xué)診斷技術(shù)的主體。病毒分離(virus isolation)是診斷病毒感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”(goldstandard)。,二、病毒的分離,病毒的分離,組織培養(yǎng)雞胚培養(yǎng)動(dòng)物接種,,組織培養(yǎng)：原代細(xì)胞：新鮮組織+

11、胰蛋白酶消化，分散+培養(yǎng)液 成——單層細(xì)胞二倍體細(xì)胞株：原代細(xì)胞傳代（為二倍體細(xì)胞）傳代細(xì)胞系：腫瘤組織或二倍體細(xì)胞自發(fā)轉(zhuǎn)化（非整倍體）,二、病毒的分離與培養(yǎng),,卵黃囊接種：用5~8d雞胚，以細(xì)長針由氣室端刺入卵黃囊，孵育后收集卵黃囊膜檢查。常用于一些嗜神經(jīng)病毒羊膜腔：用12~14d雞胚，將檢材注入羊膜腔，孵育后取羊水檢查。常用于流感病毒的初次分離尿囊腔：用9~12d雞胚，將標(biāo)本接

12、種于尿囊腔，孵育后取尿囊液檢查。常用于培養(yǎng)流感病毒和腮腺炎病毒等絨毛尿囊膜：用10~12d雞胚，無菌下開一小窗，將材料滴在絨毛尿囊膜上，孵育后觀察膜上有無斑點(diǎn)病變。常用于培養(yǎng)單純皰疹病毒，天花病毒和痘病毒,雞胚接種,絨毛尿囊膜痘病毒特異性損傷,3. 動(dòng)物接種,常用動(dòng)物 小鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猴等。 不同病毒對(duì)動(dòng)物的敏感性不同，根據(jù)病毒種類加以選擇。接種途徑 按病毒侵襲部位選擇相應(yīng)的接種途徑：乙型腦炎病毒及狂犬

13、病毒 小鼠腦內(nèi)接種柯薩奇病毒 乳鼠腹腔接種乙肝病毒 黑猩猩靜脈注射流感病毒 鼻腔滴種用途 分離鑒定病毒，制備疫苗，制備抗血清,標(biāo)本制備 濃縮標(biāo)本有以下幾種方法：① 超速離心 離心的時(shí)間和速度取決于病毒顆粒的大小和離心機(jī)轉(zhuǎn)頭的半徑，一般是30min到3h．沉淀的樣本用滅菌蒸餾水洗后再放到銅網(wǎng)上；② 超過濾法 用于分子篩的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為10000；③ 接種細(xì)胞 接種細(xì)胞增殖病毒，然

14、后快速包埋、切片；④ 免疫凝集 如有特異抗血清，且病毒已知，也可用該法濃縮病毒,三、病毒的光鏡與電鏡觀察法,光 鏡：宿主組織切片、包涵體,三、病毒的電鏡觀察法,1、正染法（超薄切片法、病組織）將細(xì)胞用戊二醛固定，然后脫水、包埋、切片、染色、觀察病毒顆粒，通常1~2 d完成。操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，但樣品可長期保存，可觀察病毒粒子形態(tài)與發(fā)生過程。2、負(fù)染法直接將病毒懸液(也可用細(xì)胞)滴在銅網(wǎng)上，用重金屬(通常用磷鎢酸)進(jìn)行染色，觀察

15、病毒顆粒，10-20min可出結(jié)果。原理：負(fù)性染料不滲入病毒顆粒，而是將病毒顆粒包繞，由于負(fù)性染料含重金屬使電子束不能穿透，病毒顆粒具有亮度，在周圍暗背景上顯示亮區(qū)——較正染法顯示的圖像清晰，可顯示病毒的結(jié)構(gòu)。缺點(diǎn)：敏感性低，要求病毒量在107／mL以上，同科病毒難于鑒別。3、投影技術(shù)4、膠體金標(biāo)記技術(shù)、與免疫學(xué)技術(shù)結(jié)合等,采用幾種電鏡技術(shù)觀察病毒粒子的形態(tài),Orf virus：口瘡病毒(接觸性膿皰皮炎),Ebola viru

16、s埃博拉病毒（正染技術(shù)）,Vaccinia virus 痘苗病毒（投影技術(shù)）,負(fù)染技術(shù),美國疾病控制和預(yù)防中心公布的一張未標(biāo)明日期的彩色電子顯微照片。它顯示出H5N1型禽流感病毒（金黃色）在MDCK細(xì)胞（綠色）培養(yǎng)液中的活動(dòng)狀態(tài),電鏡技術(shù)的應(yīng)用,研究病毒形態(tài)、鑒定 觀察病毒的形態(tài)及形態(tài)發(fā)生學(xué)過程；亞顯微結(jié)構(gòu)；病毒與宿主細(xì)胞的關(guān)系；病毒感染細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變；病毒的分類等。診斷病毒病 檢測不能在體外培養(yǎng)的病毒，如輪狀病毒、星狀

17、病毒、嵌杯病毒、HAV等都是用電鏡最先發(fā)現(xiàn)的——能進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的病毒和病毒病。,四、免疫學(xué)技術(shù),1、病毒抗原2、病毒抗體3、免疫學(xué)診斷方法免疫熒光法(IF)免疫酶法（ELISA）單克隆抗體技術(shù),血凝抑制（HI）試驗(yàn),血凝試驗(yàn)HA,瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn),五、病毒抗原檢查,可檢測細(xì)胞內(nèi)、外的游離病毒抗原。敏感、特異，簡便、快速。適用于多種病毒性疾病的早期快速診斷。,Influenzavirus A培養(yǎng)物DFA染色陽性,生殖道HSV-2涂