高壓液相色譜hplc培訓(xùn)教程(一)

1、高壓液相色譜高壓液相色譜HPLC培訓(xùn)教程培訓(xùn)教程(一)I概論一、液相色譜理論發(fā)展簡況色譜法的分離原理是：溶于流動相(mobilephase)中的各組分經(jīng)過固定相時，由于與固定相(stationaryphase)發(fā)生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。色譜法最早是由俄國植物學(xué)家茨維特（Tswett）在1906年研究用碳酸鈣分離植物色素時發(fā)現(xiàn)的，色譜

2、法(Chromatography)因之得名。后來在此基礎(chǔ)上發(fā)展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法。液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動相，稱為經(jīng)典液相色譜法，此方法柱效低、時間長（常有幾個小時）。高效液相色譜法(HighperfmanceLiquidChromatography，HPLC)是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填

3、料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會引起高阻力，需用高壓輸送流動相，故又稱高壓液相色譜法(HighPressureLiquidChromatography，HPLC)。又因分析速度快而稱為高速液相色譜法(HighSpeedLiquidChromatography，HSLP)。也稱現(xiàn)代液相色譜。二、HPLC的特點和優(yōu)點HPLC有以下特點：高壓壓力可達150~300Kgcm2。色譜柱每米降壓為75Kgcm2以上。高速流速為0.1~10.0

4、mlmin。高效可達5000塔板每米。在一根柱中同時分離成份可達100種。高靈敏度紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點：速度快通常分析一個樣品在15~30min，有些樣品甚至在5min內(nèi)即可完成。分辨率高可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果。靈敏度高紫外檢測器可達0.01ng，熒光和電化學(xué)檢測器可達0.1pg。液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(

5、RPC)。正相色譜法采用極性固定相(如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相)；流動相為相對非極性的疏水性溶劑(烷烴類如正已烷、環(huán)已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時間。常用于分離中等極性和極性較強的化合物(如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。反相色譜法一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調(diào)節(jié)保留時間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物

6、。RPC在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛，據(jù)統(tǒng)計，它占整個HPLC應(yīng)用的80%左右。隨著柱填料的快速發(fā)展，反相色譜法的應(yīng)用范圍逐漸擴大，現(xiàn)已應(yīng)用于某些無機樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5（2~8），太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。有報告新商品柱可在pH1.5~10范圍操作。正相色譜法與反相色譜法比較表正相色

7、譜法反相色譜法固定相極性高～中中～低流動相極性低～中中～高組分洗脫次序極性小先洗出極性大先洗出從上表可看出，當(dāng)極性為中等時正相色譜法與反相色譜法沒有明顯的界線（如氨基鍵合固定相）。3離子交換色譜法固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基（稱陽離子交換樹脂）或季氨基（陰離子交換樹脂）。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進行可逆交換