[教育]液相色譜(nxpowerlite)

1、色譜分析之：,液相色譜,沈曉芳,高效液相色譜法：以液體作為流動相的色譜法。它是在經典液相色譜實驗基礎上，引入氣相色譜的理論，在技術上采用高壓輸液泵，高效固定相和高靈敏的檢測器，而發(fā)展起來的快速分離分析技術。具有分離效能高，檢出限低，操作自動化和應用范圍廣的特點。,一、概述 Generalization,液相色譜儀,(一)、HPLC與經典LC區(qū)別,(二)、HPLC與GC異同點,① 近來出現的蒸發(fā)激光光散射檢測器（ELSD）是靈敏

2、度較高的通用檢測器,流動相差別GC：流動相為惰性氣體組分與流動相無親合作用力，只與固定相作用。 HPLC：流動相為液體組分與流動相和固定間有親合作用力，為提高柱的選擇性、 改善分離度增加了因素，對分離起很大作用。流動相種類較多，選擇余地廣流動相極性和pH值的選擇也對分離起到重要作用 選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動相 可以增大分離選擇性,操作條件差別 GC：加溫操作 HPLC：室溫；

3、高壓（液體粘度大，峰展寬?。?流程及主要部件,,,,三、高效液相色譜法的特點和應用,特點：“三高” “一快” “一廣” 高柱效——n=104片/米，柱效高（遠高于一般LC）高靈敏度(紫外：10-9g；熒光：10-11g)高選擇性分析速度快(＜1h)應用范圍廣泛（可分析80%有機化合物）（是高沸點、熱不穩(wěn)定有機及生化試樣的高效分離分析方法。）,1 按固定相的聚集狀態(tài)可分為： 液?液色譜法(LLC) 液?固色譜法

4、(LSC),2 按分離機制可分為： 分配色譜法 吸附色譜法 化學鍵合相色譜法 離子交換色譜法 分子排阻色譜法 親和色譜法,高效液相色譜的分類,四、流程及主要部件 process and main assembly of HPLC,1.流程,,2.主要部件,(1) 高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150～350×105 Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動

5、相高速通過時，將產生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。應具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調、耐腐蝕,死體積小，很適用于梯度洗提等特性。,(2)梯度淋洗裝置,外梯度: （低壓梯度） 一臺高壓泵, 通過比例調節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。,內梯度：（高壓梯度）采用多個高壓泵將不同的流動相增壓后送入梯度混合室混合，然后再送入色譜柱的方法。,,,,(3) 進樣裝置,流路中為高壓

6、力工作狀態(tài)， 通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置， 其結構如圖所示：,(4) 高效分離柱,柱體為直型不銹鋼管，內徑1～6 mm，柱長5～40 cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。,,常用檢測器種類 紫外檢測器（UVD）應用最多。 熒光檢測器（FD）靈敏度較高。 電化學檢測器（ECD） 示差折光檢測器（RID）是泛用型檢測器，靈敏度不高。 蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）新型檢測器。

7、發(fā)光檢測器是有發(fā)展前途的新型檢測器。,一、液-固吸附色譜liquid-solid adsorption chromatograph二、液-液分配色譜liquid- liquid partition chromatograph三、離子交換色譜ion-exchange chromatograph四、離子對色譜ion-pair chromatograph五、排阻色譜size- exclusion chromatograp

8、h六、親和色譜(AC)Affinity chromatograph,第二節(jié)主要分離類型與原理,basic principle and main separating types,一、 液-固吸附色譜liquid-solid adsorption chromatography,固定相：固體吸附劑：如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑； 流動相：各種不同極性的一元或多元溶劑，“相似相溶”原理

9、 基本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸； 適用于分離相對分子質量中等的油溶性試樣，對具有不同官能團的化合物和異構體有較高選擇性； 缺點：非線性等溫吸附常引起峰的拖尾；,二、 液-液分配色譜liquid- liquid partition chromatography,固定相與流動相均為液體（互不相溶）； 基本原理：組分在固定相和流動相上的分配； 流動

10、相：對于親水性固定液，采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定液的極性（正相 normal phase），分離極性化合物，極性小的先出峰。反之，流動相的極性大于固定液的極性（反相 reverse phase）。正相與反相的出峰順序相反。,固定相有機基團主要有三類：1.疏水基團:如不同鏈長的烷烴（ C8 ，C18 ，C6等）。2.極性基團：如丙胺基，氰乙基，醚和醇等。3.離子交換基團：如作為陰離子交換基團的胺基，季銨鹽。作為陽離子交

11、換基團的磺酸基等。,固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用； 化學鍵合固定相：將各種不同基團通過化學反應鍵合 到硅膠（擔體）表面的游離羥基上。,三、 離子交換色譜ion-exchange chromatography,鍵合相離子交換劑是以硅膠為基質，在它上面覆蓋一層如圖所示的離子交換樹脂涂層，或者在硅膠上直接鍵合離子交換基團。,固定相：陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂；,基本原

12、理：組分在固定相上發(fā)生的反復離子交換反應；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關。親和力大，保留時間長。 陽離子交換： 陰離子交換： 離子交換反應達到平衡時，保留值決定于平衡常數。容量因子k’與平衡常數K成正比，且與流動相中的反離子濃度（M+、X-）成反比。流動相：陰離子離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；陽離子離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液；應用：離

13、子及可離解的化合物，氨基酸、核酸、蛋白質等。,,,離子交換色譜法由于沒有與之相匹配的檢測器，難以發(fā)揮更大的作用。無機離子與大多數有機離子不同，只有在遠紫外區(qū)才有吸收，光度檢測器不適于檢測無機離子，而電導檢測器卻是可檢測電解質溶液的通用型檢測器，這種檢測器簡單易于操作，但是長時間以來沒有一種可以和電導檢測器相適應的分離模式。 直到 1975年Small才提出把電導檢測器用于離子交換色譜，他為了克服洗脫液中的離子對電導檢測器

14、的干擾。在分析柱和檢測器之間增加一個“抑制柱”，消除洗脫液中離子本身帶來的本底電導，他把這一方法叫做“離子色譜”（Ion Chromtatography）。這一方法提出之后受到普遍的重視，20多年來得到了長足的發(fā)展，成為分析無機和有機離子十分重要的方法，在各領域中得到廣泛的應用。,離子色譜儀,,,離子色譜法 principle of IC,(Ion Chromatography,簡稱IC) 以無機、特別是無機陰離子混

15、合物為主要分析對象, 在七十年代出現、八十年代迅速發(fā)展。,傳統(tǒng)離子交換色譜存在著兩個難于解決的問題：(1)需要高濃度淋洗液洗脫且洗脫時間很長；(2)洗脫后的組分缺乏靈敏、快速的在線檢測方法。,,離子色譜裝置類型suppressed apparatus of IC,抑制型：,,,用NaOH洗脫，但高電導背景，靈敏度差,增加抑制柱解決,解決辦法？,R-OH +NaBr ------ R-Br + NaOH,交換,洗脫,抑制柱為高容量

16、的強酸性陽離子交換劑。當試樣經陰離子交換劑的分離柱后，隨流動相進入抑制柱，在抑制柱中發(fā)生兩個重要反應：,由反應可見：經抑制柱后，一方面將大量堿轉變?yōu)殡妼Ш苄〉乃?，消除了流動相本底電導的影響。同時，又將樣品陰離子轉變成相應的酸，由于H+離子的淌度為Na+離子的7倍，提高了所測陰離子電導的檢測靈敏度。對于陰離子樣品也有相似的作用機理。,,淌度：在單位電場強度下,某種離子在一定溫度和一定介質中移動的速率,離子色譜連續(xù)抑制裝置圖,,若樣品為陽離

17、子，用無機酸作流動相，抑制柱為高容量的強堿性陰離子交換劑。當試樣經陽離子交換劑的分離往后，隨流動相進入抑制柱，在抑制柱中發(fā)生兩個重要反應：,由反應可見：經抑制柱后，一方面將大量酸轉變?yōu)殡妼Ш苄〉乃?，消除了流動相本底電導的影響。同時，又將樣品陽離子M+轉變成相應的堿，由于OH-離子的淌度為Cl-離子的2.6倍，提高了所測陽離子電導的檢測靈敏度。對于陰離子樣品也有相似的作用機理。,,在分離柱后加一個抑制柱的離子色譜亦稱為抑制型離子色譜或稱雙

18、柱離子色譜。由于抑制柱要定期再生，而且譜帶在通過抑制柱后會加寬，降低了分離度。 后來，Frits等人提出采用抑制柱的離子色譜體系，而采用了電導率極低的溶液，例如1×10-4～5×10-4mol·dm-3苯甲酸鹽或鄰苯二甲酸鹽的稀溶液作流動相，稱為非抑制型離子色譜或單柱離子色譜。 為了提高信噪比，洗脫液必須要用低電導物質，而且它的濃度要低，固定相的離子交換

19、容量也降低，這樣可使被測離子的保留時間在合理的范圍之內。,離子色譜：采用交換容量非常低的特制離子交換樹脂為固定相；細顆粒柱填料，高柱效；采用高壓輸液泵；,,低濃度淋洗液或本底電導抑制（在分離柱后，采用抑制柱來消除淋洗液的高本底電導）；可采用電導檢測器，快速分離分析微量無機離子混合物；各種抑制裝置及無抑制方法的出現，發(fā)展迅速。,離子色譜具有以下優(yōu)點,（1）分析速度快 可在數分鐘內完成一個試樣的分析；,（2）分離能力高

20、 在適宜的條件下，可使常見的各種陰離子混合物分離；例：使用雙柱法，在十幾分鐘內，可使七種陰離子完全分離。,,（3）分離混合陰離子的最有效方法（4）耐腐蝕，儀器流路采用全塑件，玻璃柱,,離子色譜的應用 application of IC,,陰離子分析: 雙柱；薄殼型陰離子交換樹脂分離柱(3×250mm), 流動相：0.003mol·L-1 NaHCO3 / 0.0024 mol&

21、#183;L-1 Na2CO3，流量138 mL/hr。 七種陰離子在20分鐘內基本上得到完全分離，各組分含量在3～50 ppm。,四、 離子對色譜ion pair chromatography,原理：將一種（或多種）與溶質離子電荷相反的離子（對離子或反離子）加到流動相中使其與溶質離子結合形成疏水性離子對化合物，使其能夠在兩相之間進行分配；,圖 離子對色譜分離過程示意圖,陰離子分離：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基

22、銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對離子； 陽離子分離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對離子； 反相離子對色譜：非極性的疏水固定相(C-18柱)，含有對離子B+的甲醇-水或乙腈-水作為流動相，試樣離子A-進入流動相后，生成疏水性離子對B+ A-后；在兩相間分配。,六、 排阻色譜size- exclusion chromatography,固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)；,原理：按分子大小分離。小分子可以擴散到凝膠空隙，由其

23、中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。 可對相對分子質量在100-105范圍內的化合物按質量分離,,排阻色譜示意圖：,,,M.W.,,tR,,,M.W.,tR,,,,,,,七、 親和色譜(AC) Affinity chromatograph,原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進行選擇性分離。,,先在載體表面鍵合上一種具有一般

24、反應性能的所謂間隔臂(環(huán)氧、聯(lián)胺等)，再連接上配基(酶、抗原等)，這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改變淋洗液后洗脫,一、液相色譜固定相stationary phase of HPLC二、液相色譜流動相 mobile phase of HPLC,第四節(jié)液相色譜的固定相與流動相,stationary phase and mobile phase of HPLC,一、液相色譜固定相

25、 stationary phases of LC,1. 液-液分配及離子對色譜分離固定相 （1）全多孔型擔體 由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；早期采用100μm的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多見； 現采用10μm以下的小顆粒，化學鍵合制備柱填料；,,（2）表面多孔型擔體 （薄殼型微珠擔體） 30～40μm的玻璃微球，表面附著一層厚度為1 ～ 2

26、μm的多孔硅膠。 表面積小，柱容量低；,（3）化學鍵合固定相,化學鍵合固定相: 目前應用最廣、性能最佳的固定相。制備鍵合固定相一般有如下幾種途徑：1.用醇或胺與硅醇基反應，形成≡Si—O—C硅氧碳鍵型和 硅氮≡Si—N—C鍵型. 本法的缺點是產物容易水解和醇發(fā)生交換反應，因此僅 適用已干燥的無水乙醇為流動相。2.用有機氯硅烷與硅醇反應，形成≡Si—O—Si —C硅氧硅碳鍵型.

27、 本法的最大優(yōu)點是固定相的熱穩(wěn)定性好。不易吸水，耐有機溶劑。能在70 0C, pH=2-8正常工作，因此應用特別廣泛。3.通過硅膠與鹵代烷反應，形成≡Si—C硅碳鍵型,硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si — C 穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機溶劑，應用最廣,,化學鍵合固定相的特點,（1）傳質快，表面無深凹陷，比一般液體固定相傳質快；（2）壽命長，化學鍵合，無固定液流失，耐流動相沖擊；（3）穩(wěn)定性好，耐水、

28、耐光、耐有機溶劑，穩(wěn)定； （4）選擇性好，可鍵合不同官能團，提高選擇性；（5）有利于梯度洗脫；,,存在著雙重分離機制：(鍵合基團的覆蓋率決定分離機理)高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主； （封尾）,2. 液-固吸附分離固定相,種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等； 結構類型：全多孔型和薄殼型； 粒度：5～10 μm；,3. 離子交換色譜分離固定相,結構類別：（1）薄殼型離子交換樹脂

29、 薄殼玻璃珠為擔體，表面涂約1%的離子交換樹脂；（2）離子交換鍵合固定相 薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵合型（鍵合離子交換基團） 樹脂類別：（1） 陽離子交換樹脂（強酸性、弱酸性）（2） 陰離子交換樹脂（強堿性、弱堿性）,,,4. 空間排阻分離固定相,（1）軟質凝膠 葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網狀結構； 水為流動相。適用于常壓排阻分離。（2）半硬質凝膠

30、苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機凝膠； 非極性有機溶劑為流動相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑（3）硬質凝膠 多孔硅膠、多孔玻珠等； 化學穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機械強度大，流動相性質影響小，可在較高流速下使用。 可控孔徑玻璃微球，具有恒定孔徑和窄粒度分布。,二、液相色譜的流動相 Mobile phases of LC,1. 流動相特性 （1）液相色譜的流動相又

31、稱為：淋洗液，洗脫劑。流動相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況； （2）親水性固定液采用疏水性流動相，即流動相的極性大于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。 （3）若流動相的極性小于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。,2. 流動相類別,按流動相組成分：單組分和多組分； 按極性分：極性、弱極性、非極性；

32、 按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。 常用溶劑： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、甲醇、水。 采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進分離或調整出峰時間。,3. 流動相選擇,在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據。 采用正相液-液分配分離時：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時間太短，降低溶劑極性，反之增加。 也可在低

33、極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時間縮短。 常用溶劑的極性順序： 水(最大) > 甲酰胺> 乙腈> 甲醇> 乙醇> 丙醇> 丙酮> 二氧六環(huán)> 四氫呋喃> 甲乙酮> 正丁醇> 乙酸乙酯> 乙醚> 異丙醚> 二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷&

34、gt;煤油(最小),4. 選擇流動相時應注意的幾個問題,（1）盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。,（2）避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。,（3）試樣在流動相中應有適宜的溶解度，防止產生沉淀并在柱中沉積。,（4）流動相同時還應滿足檢測器的要求。當使用紫外檢測器時，流動相不應有紫外吸收。,選擇高效液相中溶劑的示意圖,一、影響分離的因

35、素 factors influenced separation,影響分離的因素與提高柱效的途徑 在高效液相色譜中, 液體的擴散系數僅為氣體的萬分之一，則速率方程中的分子擴散項B/U較小，可以忽略不計， 根據Van Deemter方程，板高H ： u 為流動相線速度； A—分別表示渦流擴散系數； B—分子擴散系數；

36、 C—傳質阻力系數（包括液相和固相傳質阻力系數）。H = A + C u 故液相色譜H-u曲線與氣相色譜的形狀不同，如圖所示。,,,液體的黏度比氣體大一百倍，密度為氣體的一千倍，故降低傳質阻力是提高柱效主要途徑。 由速率方程， 降低固定相粒度可提高柱效。,液相色譜中，不可能通過增加柱溫來改善傳質。 改變淋洗液組成、極性是改善分離的最直接的因素。,,2.流速

37、,,流速大于0.5 cm/s時, H～u曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。但在實際操作中，流量是一個調整分離度和出峰時間的重要參數。,3.固定相及分離柱 氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項技術要求非常高的工作，一般很少自行制備。,速率方程可簡化為：,,Dm、Ds—試樣分子在流動相、固定液中的擴散系數

38、 關鍵是將H變小，而H變小關鍵是使為填料粒徑 dp變小，固定液液膜厚度 df變小。因此采用3～5?m 固定相顆粒，且鍵合相層薄，因此df就小，由于H很小，n很多，R大改進，實現了高效。 在分離良好的基礎上，才可提高流動相線速，節(jié)省了分析時間，從而實現了高速分離。,如何實現高速分離？,影響色譜峰擴展的因素,二、分離類型選擇 choice of separation types,,理想

39、的HPLC檢測器應具有如下特性：   第一，具有高靈敏度；第二，對樣品所有組分都有響應，適用范圍廣；第三，溫度和洗脫液流速的變化對響應沒有影響；第四，響應與洗脫液組成無關，因此可作梯度洗脫；第五，死體積小，不造成柱外譜帶擴展；第六，使用方便、可靠、耐用，易清洗和檢修；第七，響應值隨樣品組分量的增加而線性增加，線性范圍寬；第八，不破壞樣品組分；第九，能對被檢測的峰提供定性和定量信息；第十

40、，響應時間快。,5 液相色譜檢測器,,,檢測器的分類 ：,紫外檢測器特點： 應用最廣，對大部分有機化合物有響應。 靈敏度高； 線形范圍高； 流通池可做的很?。?mm × 10mm ，容積 8μL）； 對流動相的流速和溫度變化不敏感； 波長可選，易于操作； 可用于梯度洗脫。,,B. 光電二極管陣列檢測器,光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列

41、，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。,,光電二極管陣列檢測器,,示差折光效應,示差折光檢測器,Differential Refractive Index Detector,c. 示差折光檢測器（differential refractive index detector）,除紫外檢測器之外應用最多的檢測器； 可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數差值。差值與濃度呈正比；,優(yōu)點：通用型檢測

42、器（每種物質具有不同的折光指數）； 缺點：靈敏度低、對溫度敏感、不能用于梯度洗脫； 分類：偏轉式、反射式和干涉型三種；,示差折光檢測器,,,熒光檢測器,熒光，又作“螢光”，是指一種光致發(fā)光的冷發(fā)光現象。當某種常溫物質經某種波長的入射光（通常是紫外線或X射線）照射，吸收光能后進入激發(fā)態(tài)，并且立即退激發(fā)并發(fā)出比入射光的的波長長的出射光（通常波長在可見光波段）；,熒光：從激發(fā)態(tài)分子衰變?yōu)樽孕嘀囟认嗤幕鶓B(tài)或低激發(fā)態(tài)時的自發(fā)發(fā)射現象。,熒

43、光檢測器,熒光檢測器特點：（fluorescence detector）,高靈敏度；高選擇性；對多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應；缺點：應用范圍有限,電化學檢測器,安培檢測器：隨著化合物被氧化或還原，產生正比于濃度的電流,電導檢測器,Conductivity Detector,制備型液相色譜：結構與分析型一樣，但泵流量大、進樣量大、采用制備柱；柱后餾分收集器。 制

44、備柱：內徑20～50mm，柱長50cm。半制備柱（內徑8mm，長度15 ～ 30cm），一次制備量０.1～１mg；,,四、制備型液相色譜 preparative liquid chromatography,1.色譜柱的柱容量（柱負荷） 對分析柱：不影響柱效時的最大進樣量； 對制備柱：不影響收集物純度時的最大進樣量； 超載：進樣量超過柱容量。柱效迅速下降，峰變寬。 超載可提高制備效率，以柱

45、效下降一半或容量因子k降低10%為宜。,2. 液相制備色譜的方法,收集組分時： （1）主峰使用制備柱，超載提高效率； （2）兩主成分之間的小組分； 超載，分離切分使待分離組分成為主成分（富集）后，再次分離制備。,一、超臨界流體色譜的特點與原理feature and principle of SFC二、超臨界流體色譜儀的結構流程structure and general process of SFC 三、超臨

46、界流體色譜的應用application of SFC,五 超臨界色譜,Supercritical fluid chromatograph, SFC,一、超臨界流體色譜的特點與原理Principle and character of supercritical fluid chromatography,1.概述 超臨界流體：溫度及壓力均處于臨界點以上的液體叫超臨界流體(Supercritical fluid)。性質介于液

47、體和氣體之間。 超臨界流體色譜(SCF)具有液相、氣相色譜不具有的優(yōu)點:,,（1）可處理高沸點、不揮發(fā)試樣；（2）比LC有更高的柱效和分離效率。,2. 超臨界流體性質,（1）性質介于液體和氣體之間; 具有氣體的低黏度、液體的高密度，擴散系數位于兩者之間。（2）可通過改變超臨界流體的密度（程序改變）調節(jié)組分分離（類似于氣相色譜的程序升溫，液相色譜中的梯度淋洗）。 (3) 超臨界流體的密度與壓力有關。,3.超臨界色譜

48、原理,SFC的流動相：超臨界流體；CO2、N2O、NH3 SFC的固定相：固體吸附劑（硅膠）或鍵合到載體（或毛細管壁）上的高聚物；可使用液相色譜的柱填料。填充柱SFC和毛細管柱SFC； 分離機理：吸附與脫附。組分在兩相間的分配系數不同而被分離； 通過調節(jié)流動相的壓力（調節(jié)流動相的密度），調整組分保留值；,壓力效應：,SFC的柱壓降大（比毛細管色譜大30倍），對分離有影響（柱前端與柱尾端分配系數相差很大，產生壓力效

49、應）；超臨界流體的密度受壓力在臨界壓力處最大，超過該點，影響小;壓力效應：壓力變化對容量因子產生顯著影響，超流體的密度隨壓力增加而增加，密度增加提高溶劑效率，淋洗時間縮短。 CO2流動相，當壓力改變：7.0→9.0×106 Pa，則： C16H34的保留時間 25min → 5min。,程序升壓,HPLC與SFC比較,二、超臨界流體色譜的結構與流程instrument structure a

50、nd the general process of SFC,1.結構流程,2.主要部件,（1）SFC的高壓泵 無脈沖的注射泵；通過電子壓力傳感器和流量檢測器，計算機控制流動相的密度和流量； （2）SFC的色譜柱和固定相 可以采用液相色譜柱和交聯(lián)毛細管柱； SFC的固定相：固體吸附劑（硅膠）或鍵合到載體（或毛細管壁）上的高聚物；專用的毛細管柱SFC；,主要部件,（3）流動相 SF

51、C的流動相：超臨界流體；CO2、N2O、NH3 CO2應用最廣泛；無色、無味、無毒、易得、對各類有機物溶解性好，在紫外光區(qū)無吸收；缺點：極性太弱；加少量甲醇等改性；（4）檢測器 可采用液相色譜檢測器，也可采用氣相色譜的FID檢測器,液相色譜實用技術,色譜柱的使用及保養(yǎng),色譜柱的保養(yǎng)（一）,樣品方面除去微粒及雜質了解樣品在流動相中的溶解度如樣品的溶劑不是流動相，一定要用流動相試溶解度，防止其在流動相中析出

52、了解樣品與色譜柱的基質/填料是否相互作用,色譜柱的保養(yǎng)（二）,流動相方面除去微粒純度的要求超純水，梯度實驗時水中有機雜質含量要低緩沖液的pH值，在填料的允許范圍內緩沖液（鹽）的濃度溶劑：色譜純，并與填料相匹配溶劑中的雜質含量流動相對樣品的溶解度有機溶劑或水的比例,在線的保護裝置,給色譜柱提供物理的保護除去樣品及流動相中的顆粒給色譜柱提供化學的保護防止分析柱被化學污染裝置在線過濾器自裝填料保護柱預裝保護柱,

53、在線過濾器,In-Line Filter防止顆粒在色譜柱頭累積優(yōu)點：基本不影響柱效在需要高柱效的分析時中常用（如：氨基酸分析）,保護柱,可避免化學污染。多數保護柱影響到整個色譜柱的柱效，特別是在用微柱時保護柱的種類普通自裝填料的保護柱用戶自裝填料影響柱效同裝填技術有關，柱效降低較大預裝保護柱有各種填料的預裝柱供選擇，使用方便。填料容積較小，也引起柱效降低,色譜柱的清洗,對所做的樣品要有充分的了解用對該樣品洗脫能力最

54、強的流動相清洗硅膠柱的一般方法先用甲醇洗去極性雜質用干燥的二氯甲烷、正庚烷100~200ml依次活化鍵合相柱(烷基)的一般方法20倍柱體積的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次沖洗,色譜柱的存放,存放前的處理除去雜質、鹽合適的存放溶劑避免色譜柱床的干枯避免機械震動防止細菌生長注意存放的溫度,色譜柱常見毛病,柱壓過高多少才算高?不同色譜柱有差異不同系統(tǒng)有差異不同溶劑有差異柱效低重復性差不出峰，回收率低,柱壓過高,

55、為什么柱壓會過高微粒堵塞樣品流動相密封墊柱床膨脹不可逆吸附細菌生長,柱效低,為什么柱效低色譜柱被污染過濾片部分堵塞樣品、流動相或密封墊的細小顆粒造成的堵塞色譜柱內的死體積流動相pH值及組成不合適造成固定相流失流速急劇變化造成固定相物理損壞機械震動造成固定相產生裂縫柱床收縮或干枯,重復性差、回收率低,實驗的重復性差色譜柱被污染流動相pH值及組成不合適造成鍵合相流失樣品溶劑不同或樣品本身不穩(wěn)定回收率低，

56、不出峰“不可逆”吸附固定相過強或流動相過弱非特異性吸附,色譜柱以外的因素（一）,“柱效”問題，不一定是色譜柱問題！儀器問題：連接不好造成死體積進樣器檢測器管路，連接口保護柱在線過濾器堵塞流動相問題：色譜柱未平衡好進樣量太大,色譜柱以外的因素（二）,柱壓過高問題，不一定是色譜柱問題！系統(tǒng)反壓問題阻尼器堵塞進樣器堵塞管路或連接口堵塞在線過濾器不干凈保護柱壓力傳感器不準確流速是否錯誤?,色譜柱以外的因素（

57、三）,實驗的重復性差梯度實驗時平衡時間不足溫度波動流動相組成改變樣品溶劑不同樣品穩(wěn)定性不好方法的開發(fā)不好緩沖液的pH值不合適緩沖液的緩沖能力不足,簡單的判別方法,高的柱反壓是否伴隨著保留時間變化? 峰形變壞? 分辨率變壞? 測量色譜系統(tǒng)的譜帶展寬典型的分析系統(tǒng)應遠小于 100 微升如大于此數應檢查儀器系統(tǒng),流動相及樣品的預處理,液相色譜實用技術（二）,液相色譜對流動相的要求,除色譜柱對流動相的要求外，還有∶

58、與檢測器匹配脫氣避免鹵素離子（不銹鋼系統(tǒng)）溶劑的粘度細菌的生長,流動相的脫氣,流動相脫氣的目的使色譜泵的輸液準確輸液均勻準確，并且脈動減小保留時間及色譜峰面積的重現性提高提高檢測的性能防止氣泡引起的尖峰基線穩(wěn)定，信噪比增加溶劑的紫外吸收本底降低保護色譜柱減少死體積防止填料的氧化,流動相脫氣的方法,加熱簡單，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流動相組成的變化抽真空同上，一般在溶劑抽濾的同時，也有脫

59、氣的效果超聲波簡單，但效果不理想。通惰性氣體（一般用氦氣）可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度脫氣機可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度,樣品的預處理,樣品預處理的目的除去微粒減少干擾雜質濃縮微量的組份提高檢測的靈敏度及選擇性改善分離的效果有利于色譜柱及儀器的保護,樣品的預處理重要性,占樣品分析時間的比例樣品預處理所用時間遠大于色譜分離的時間占分析的消耗總成本最大消耗大量的溶劑及其他化學品實驗的重復性及準確性最差的環(huán)

60、節(jié)影響實驗結果好壞的最重要因素 是決定性的步驟,樣品預處理常用的方法,高速離心過濾、超濾選擇性沉淀衍生反應液-固萃取 / 液-液萃取其他,樣品預處理的過程,去除微粒,過濾過濾膜/過濾裝置有機(0.5μm)/無機(0.45μm)膜片可更換一次性使用的膜使用方便簡單，交叉污染小有更小內徑，可用于微量樣品的處理高速離心大于：10,000g,超濾,機理超濾是一種基于分子量分離的技術目的根據分子量的不同把分子、

61、細胞及病毒等分為不同的餾份除去小分子樣品中的大分子蛋白脫鹽,選擇性沉淀,常用于生化樣品中除蛋白有機溶劑乙腈，甲醇強酸三氯乙酸，過氯酸鹽50% 硫酸銨10%三氯乙酸（TCA）,樣品衍生,提高檢測的靈敏度增加紫外基團以增強紫外檢測的靈敏度增加熒光基團使樣品用高靈敏度熒光檢測器改變分離的選擇性改變組份的基團，如：變離子型化合物為非離子型，用反相方法分離典型的例子氨基酸分析,樣品衍生∶氨基酸分析,AccQ-Tag