經(jīng)典色譜法液相

1、1,第10章 經(jīng)典液相色譜法,液相色譜法：以液體為流動相的色譜法稱～。,經(jīng)典液相色譜：固定相顆粒較大且不均勻 常壓下輸送流動相 柱效較低 分析周期長現(xiàn)代液相色譜：固定相顆粒小且均勻 高壓下輸送流動相 柱效較高

2、 分析周期短,2,第1節(jié) 液-固吸附柱色譜(LSC),（一）分離原理（二）常用吸附劑（三）色譜條件的選擇 (四) 操作方法,3,各組分與流動相分子爭奪吸附劑表面活性中心， 利用吸附劑表面的活性吸附中心對不同組分的吸附 能力差異而實(shí)現(xiàn)分離，吸附能力大小用吸附平衡常數(shù)K表示,（一）分離原理,1.吸附與吸附平衡,4,2.吸附等溫線：一定溫度下，某一組分固定相和流動相之間達(dá)到平衡時，以Cs為縱坐標(biāo)，

3、Cm為橫坐標(biāo)得到的曲線。,類型：線性、凸形、凹形等溫線,5,吸附等溫線,色譜柱內(nèi)溶液濃度的分布,流出曲線,6,當(dāng)吸附等溫線是線性時,流出曲線是對稱的,當(dāng)吸附等溫線是凸型或凹型時，流出曲線形成拖尾峰或前延峰，克服方法：減少進(jìn)樣量或樣品濃度，利用等溫線的直線部分，防止超載。,7,（二）、吸附劑,對吸附劑的要求：（1）具有較大的表面積和一定的吸附能力（2）顆粒要有一定的細(xì)度(d=75-150μm，即100-200目)，且粒度均勻（3）

4、與洗脫劑及樣品不起反應(yīng)，不溶解于洗脫劑,常用：硅膠、氧化鋁、聚酰胺、活性炭、大孔樹脂,8,吸附機(jī)制： 表面的硅醇基，與物質(zhì)形成氫鍵,適用范圍：微酸性（pH=4~5）， 適于酸性和中性物質(zhì),失活：水與硅醇基結(jié)合使其失去活性,活化：105-110℃加熱30min,粒度：100-200目,1. 硅膠（SiO2·H2O）中等極性吸附劑,9,堿性氧化鋁 pH 9～10 適于分析堿性、中性物質(zhì) 如：生物堿

5、 中性氧化鋁 pH 7.5 適于分析酸性、堿性和中性物質(zhì) 如：生物堿、揮發(fā)油、萜類、甾體及在酸堿中不穩(wěn)定的苷類、酯、內(nèi)酯等化合物 酸性氧化鋁 pH 4～5 適于分析酸性、中性物質(zhì) 如：酸性色素、氨基酸、對酸穩(wěn)定的中性物質(zhì),2. 氧化鋁：吸附力較強(qiáng),10,硅膠、氧化鋁的含水量與活性關(guān)系,活度測定法：Brockmamn法,結(jié)論：含水量越低，活度級別越小，吸附力越強(qiáng)。,11,,3、聚酰胺,商品名：錦綸、尼龍-6不

6、溶于水和有機(jī)溶劑，易溶于濃無機(jī)酸,,分離機(jī)制：主要是氫鍵吸附,適用對象：黃酮類、鞣質(zhì)、醌,粒度：20~200目,氫鍵能力↑強(qiáng)組分越后出柱,12,4、大孔樹脂,是一種具有大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子吸附劑。不溶于酸、堿及有機(jī)溶劑,分類：非極性和中等極性,特點(diǎn)：在水中吸附力較強(qiáng)，在有機(jī)溶劑中吸附力較弱,適用對象：皂苷類、黃酮苷類化合物,粒度：20~60目,13,（三）色譜條件的選擇：,1. 被測組分性質(zhì)（極性大?。?烷烴＜烯烴＜醚&l

7、t;硝基化合物<二甲胺＜酯＜酮＜醛<胺＜酰胺＜醇＜酚＜羧酸,依據(jù)被測組分、吸附劑和流動相的性質(zhì),2. 吸附劑的選擇： 吸附劑的活性↑大，對被測組分的吸附能力↑強(qiáng) 強(qiáng)極性物質(zhì)——選擇弱吸附劑 弱極性物質(zhì)——選擇強(qiáng)吸附劑,酸性成分：硅膠 堿性成分：氧化鋁 黃酮類：聚酰胺,15,“相似相溶”原則 ：分離極性大的物質(zhì)應(yīng)選用極性大的溶劑作流動相，分離極性小的物質(zhì)應(yīng)選用極性小的溶劑作流動相,,3、流動

8、相的選擇,流動相極性順序：石油醚< 環(huán)已烷<苯<甲苯<乙醚<三氯甲烷<乙酸乙酯<丙酮<正丁醇<乙醇<甲醇<水常用：混合溶劑 如：不同配比的甲醇-水或甲醇 親脂性成分用氯仿、乙酸乙酯,16,4. 三者關(guān)系：,組分 吸附劑 流動相極性大 活性小 極性非(弱)極性 活性大

9、非極性或弱極性,17,（四）、操作方法,2、上樣,3、洗脫,1、色譜柱的制備 要求：填裝均勻、緊密，不能有氣泡。 裝柱時柱要垂直，表面平整。 固定相的用量適宜。 柱體：色譜柱 固定相：顆粒大小100-200目，用量 方法：干法裝柱、濕法裝柱,4、檢視,18,第2節(jié) 液-液分配柱色譜法（LLC）,一、基本原理,原理：利用不同組分在固定相中溶解度不同，而

10、進(jìn)行分離,過程：,19,二、載體,作用：支撐與分散固定液的作用,要求：1）化學(xué)惰性，不易與其它物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)2）對被分離組分沒有吸附能力3）能吸留較大量的固定相液體,常用載體：硅膠、硅藻土、纖維素等,20,三、固定液、流動相及其選擇,分類：正相分配色譜和反相分配色譜,正相分配色譜：固定液極性大于流動相固定液：水、各種緩沖溶液、甲醇等強(qiáng)極性物質(zhì)流動相：石油醚、三氯甲烷等低極性物質(zhì)適合分離的物質(zhì)：極性物質(zhì)各種極性物質(zhì)流出順序：t

11、非極性< t中極性< t強(qiáng)極性,21,反相分配色譜：固定液極性小于流動相固定液：硅油、液狀石蠟等極性小物質(zhì)流動相：水、與水相混溶的有機(jī)溶液適于分離物質(zhì)：中等極性至非極性物質(zhì)各種極性物質(zhì)流出順序：t極性< t中極性< t非極性,22,選擇原則： 固定液與流動相的選擇，要根據(jù)被分離物中各組分在兩相中的溶解度之比即分配系數(shù)而定。可先使用對各組分溶解度大的溶劑為洗脫劑，再根據(jù)分離情況改變洗脫劑的組成，即在流動相中

12、加入一些可調(diào)節(jié)溶解度的溶劑．以改變各組分被分離的情況與洗脫速率。,23,四、操作方法,1.固定液的涂布與裝柱： 裝柱前，首先將固定液與載體混合均勻,2.加樣與洗脫：加樣方法：①試樣配成濃溶液 ；② 試樣溶液用少量固定相吸附，待溶劑揮干后，加入柱內(nèi)； ③用一塊比色譜柱內(nèi)徑略小的圓形濾紙吸附試樣溶液，待溶劑揮發(fā)后，加入柱內(nèi),24,洗脫：洗脫時流動相應(yīng)先與固定相互相飽和，防止固定相流失,應(yīng)用：適合各種類型化合物的分離,25,第3節(jié) 離

13、子交換柱色譜法（IEC）,1、離子交換樹脂：樹脂：母體骨架是苯乙烯和二乙烯苯聚合而成的球形網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子聚合物,-SO3H、-COOH 陽離子交換樹脂 -N(CH3)3+、-NH2 陰離子交換樹脂,定義：利用離子交換劑對各組分交換性能的差異使其分離分析的方法,26,樹脂酸性強(qiáng)度次序,交換與再生反應(yīng),27,交換與再生反應(yīng),①交聯(lián)度：交聯(lián)劑（如二乙烯苯）的用量，重量百分比表示陽離子交換樹

14、脂交聯(lián)度以8％，陰離子交換樹脂交聯(lián)度以4％左右為宜。高交聯(lián)度樹脂緊密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，交換速度慢，但選擇性好，反之，則具有較好的滲透性，選擇性差。,2、性能,29,②交換容量：每克干樹脂含有可交換基團(tuán)的數(shù)目，單位以mmol/g表示。交換容量表示離子交換樹脂進(jìn)行離子交換能力大小。實(shí)際交換容量與理論有所不同。,③溶脹：樹脂吸收水分后，引起的膨脹。溶脹程度取決于交聯(lián)度高低，交聯(lián)度高，溶脹小，反之，溶脹大。,30,④粒度：交換樹脂顆粒的大小，一

15、般以溶脹狀態(tài)下通過的篩孔來表示。顆粒小，離子交換達(dá)到平衡快，但洗脫慢。,31,3、離子交換平衡,平衡常數(shù)KA/B也稱離子選擇性系數(shù)，是衡量某樹脂交換能力大小的一種量度。K越大，保留時間越長。,32,4、影響選擇性系數(shù)的因素,離子價數(shù)越高，水合離子半徑越小和離子交換樹脂的親和力越大，即選擇系數(shù)越大,（1）強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂不同價態(tài)的離子，電荷越高，親和力越強(qiáng)，選擇性系數(shù)越大，如Th4+ ＞Al3+ ＞Ca2+＞Na+

16、一價陽離子的親和力順序?yàn)锳g+ ＞Tl+ ＞Cs+ ＞Rb+ ＞K+ ＞NH4+ ＞Na+ ＞H+＞Li+,33,（2）強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂 陰離子的親和力順序?yàn)闄幟仕岣維O42-＞CrO42-＞I-＞HSO4-＞NO3-＞Br-＞CN-＞NO2-＞Cl-＞HCOO-＞CH3COO-＞OH-＞F-,34,5、操作方法及應(yīng)用,（1）樹脂處理和再生,處理目的：除去雜質(zhì)、轉(zhuǎn)變?yōu)樗枰男问?陽離子樹脂轉(zhuǎn)變?yōu)闅湫?，陰離子樹脂轉(zhuǎn)變?yōu)槁?/p>

17、型或羥基型。處理方法：樹脂再生：,35,（2）裝柱處理好的樹脂加少量水?dāng)嚢韬蟮谷肷V柱中，注意防止氣泡進(jìn)入。,（3）洗脫洗脫劑一般為水，或弱酸弱堿溶液，必要時加入少量有機(jī)溶劑,（4）應(yīng)用除去干擾離子，微量元素的富集、水的純化等,36,第4節(jié) 空間排阻柱色譜法（SEC）,又稱為凝膠色譜法、分子排阻色譜法、分子篩色譜法和尺寸排阻色譜法,作用：用于大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、多糖的分離,37,一、基本原理分子篩效應(yīng)：分子排阻色譜是根據(jù)溶

18、質(zhì)分子大小的不同即分子篩效應(yīng)而進(jìn)行分離的。,大分子的流程短，移動速度快，先流出色譜柱；小分子的流程長，移動速度慢，后流出色譜柱；而中等分子居兩者之間，可使分子大小不一樣的混合組分實(shí)現(xiàn)分離。,38,滲透系數(shù)K 溶膠孔穴內(nèi)外同等大小的溶質(zhì)分子處于擴(kuò)散平衡狀態(tài)。,,,滲透系數(shù)K由溶質(zhì)分子的體積大小與孔穴的孔徑大小的相對關(guān)系決定，與流動相的種類無關(guān)。,K越大，保留時間越長,39,三、操作方法及應(yīng)用 （自學(xué)）,二、凝膠的分類 （自學(xué)）,4

19、0,小結(jié),經(jīng)典液相柱色譜的主要用途： 色譜分析前樣品預(yù)處理、化學(xué)分離 熟悉各種柱的使用 掌握常用吸附劑的性質(zhì) 掌握色譜條件的選擇 掌握洗脫規(guī)律,41,第5節(jié) 薄層色譜法（Thin Layer chromatography，TLC）,1、定義：將固定相(吸附劑)均勻地鋪在具有光潔表面的薄板上形成薄層，在此薄層上進(jìn)行色譜分離的方法。,薄板：玻璃、塑料薄膜、鋁箔吸附劑：硅膠、氧化鋁,

20、42,操作形式:平面流動相：展開劑操作：點(diǎn)樣、展開驅(qū)動力:毛細(xì)管力,43,特點(diǎn)：①分析時間短 ②分離能力強(qiáng)，一次可分離多個組分③靈敏度高④檢視方便⑤設(shè)備簡單,分類：1.按分離機(jī)理分：吸附、分配、離子交換、空間排阻色譜等。2.按薄層板的分離效率不同：經(jīng)典薄層色譜法和高效薄層薄層色譜法,應(yīng)用：藥物的定性鑒別,44,一、基本原理及名詞術(shù)語,1.分離過程：以吸附薄層色譜法為例由于各組分與吸附劑具有不同的吸附能力，展開劑對各組分

21、的溶解能力不同，即各組分有不同的吸附平衡常數(shù)，因此在展開過程中，產(chǎn)生差速遷移，實(shí)現(xiàn)分離。,45,3、比移值（Rf）,可用范圍：0.2-0.8 最佳范圍：0.3-0.5,2、原點(diǎn)、溶劑前沿、展距,分離的前提： k不同,46,1、Rf與K有關(guān)，即與組分性質(zhì)（溶解度）以及薄層板和展開劑的性質(zhì)有關(guān)2、色譜條件一定，Rf只與組分性質(zhì)有關(guān)，是薄層色譜基本定性參數(shù)，說明組分的色譜保留行為,討 論,3. 相對比移值Rs,討論參考物與被測組分在

22、完全相同條件下展開 可以消除系統(tǒng)誤差，大大提高重現(xiàn)性和可靠性；參考物可以是后加入純物質(zhì)，也可是樣品中已知組分相對比移值Rs與組分、參考物性質(zhì)及色譜條件有關(guān)，范圍可以大于或小于1,48,二、固定相,常用的固定相：硅膠、氧化鋁、聚酰胺等,粒度：200~300目,吸附劑的選擇：根據(jù)樣品的性質(zhì)如極性、酸堿性及溶解度來選擇如：氧化鋁一般適合堿性物質(zhì)和中性物質(zhì)的分離硅膠適用于酸性及中性物質(zhì)的分離,1.硅膠：硅膠H、硅膠G、硅膠HF

23、254、硅膠GF254,G：指含煅石膏(Gypsum)黏合劑H：不含黏合劑F254：含一種在254nm下能發(fā)出黃綠色熒光的無機(jī)熒光劑F365：含熒光劑，365nm紫外光照發(fā)光,粒度：10~40μm(250~300目）,含熒光劑的硅膠適用于本身不發(fā)光又無適當(dāng)顯色劑顯色的物質(zhì),50,三、展開劑,展開劑選擇：主要根據(jù)被分離物質(zhì)的極性、吸附劑的活性及展開劑本身的極性來選擇,組分 吸附劑 流動相極性大

24、 活性小 極性非(弱)極性 活性大 非極性或弱極性,51,制板 點(diǎn)樣 展開 檢視,四、操作方法,52,（一）制板,（2）粘合劑：水或0.3~0.7%CMC-Na，用量1:3,（3）涂鋪厚度：0.3mm，0.5mm,（4）活化：自然晾干后，105℃烘1h,（5）貯備：干燥器,（1）載板的準(zhǔn)備：多用玻璃板，要求表面光滑，平整清潔。常用規(guī)格：10cm&#

25、215;10cm、20cm×20cm、載玻片等,53,薄層板的鋪制方法（1）手工涂鋪法（2）機(jī)械涂鋪法（半自動、全自動）（3）燒結(jié)玻璃法,54,（1）樣品溶液的制備： 一般用溶解度大，低沸點(diǎn)、弱極性、易揮發(fā)的有機(jī)溶劑。不宜用水。,（2）器具：毛細(xì)管、微量注射器、自動點(diǎn)樣器,2、點(diǎn)樣,（3）點(diǎn)樣量：1~10μl,操作要點(diǎn)：溶解樣品的溶劑、點(diǎn)樣量和正確的點(diǎn)樣方法,55,（4）點(diǎn)樣方法：垂直方向，不能用力太大,（5）點(diǎn)樣

26、后溶劑須揮干,點(diǎn)樣斑點(diǎn)直徑≤2mm,一般為圓點(diǎn)，或條帶狀,,56,1) 展開裝置：展開槽（層析缸）,3、展 開,單槽,雙槽,57,展距：8~15cm,2）展開方式,a 上行法展開、近水平展開方式,58,b 單向多次展開：取展開一次后的薄層板，揮干溶劑，再用同一種展開劑，按同樣的展開方向進(jìn)行多次展開，以達(dá)更好的分離效果。,一次展開,多次展開,59,c 單向多級展開：取一次展開后的薄層板，揮干溶劑，再改用另一展開劑，按同樣的展開方向進(jìn)行多

27、次展開，以達(dá)更好分離效果。,d 雙向展開：取一次展開后的薄層板，揮干溶劑，將薄層板旋轉(zhuǎn)90°，再改用另一種展開劑展開，以達(dá)更好分離效果。,對象：極性相差較大的組分,對象：復(fù)雜體系中極性相差較小的組分,60,3）注意事項(xiàng),a 層析缸必須密閉良好 b 防止邊緣效應(yīng)邊緣效應(yīng)：同一物質(zhì)的色譜斑點(diǎn)在同一薄層板上出現(xiàn)的兩邊緣的Rf值大于中間部分的Rf值的現(xiàn)象。,61,原因：色譜缸內(nèi)溶劑蒸氣未達(dá)飽和，造成展開劑的蒸發(fā)速率在薄層板兩邊與中

28、間部分不等,克服辦法： a “預(yù)飽和” b 層析缸內(nèi)壁貼浸濕的濾紙條 c 點(diǎn)樣時不要太靠邊緣,62,c 在展開過程中注意恒溫恒濕,溫度和濕度的改變會影響Rf值和分離效果，降低重現(xiàn)性。,對展開劑的基本要求：? 不與組分或吸附劑存在化學(xué)反應(yīng)? 使樣品各組分完全分離? 使待測組分的Rf在0.3~0.5? 展開后各斑點(diǎn)圓而集中，不拖尾? 具有適中的沸點(diǎn)和小的粘度? 臨

29、用前配制,4）展開劑,64,展開劑的組成：單一溶劑、多元溶劑 單一溶劑：重現(xiàn)性好，分離能力差 多元展開劑：可改善分離效果，重現(xiàn)性差,展開系統(tǒng)的優(yōu)化,優(yōu)化原則：先調(diào)整展開劑極性使待測組分Rf值適中，保持這個極性不變，改變展開劑的選擇性，直至所有組分有合適的分離度,Stahl圖解法,Rf值的決定因素：①組分極性②展開劑的極性 ③吸附劑的活性,66,,,? 加入少量的酸堿,常用酸：甲酸、冰醋酸常用堿：濃氨水、乙

30、二胺,,,? 展開劑用量：展開劑浸沒薄板下端約0.5cm,67,附：常用展開系統(tǒng)人參皂苷、黃芪甲苷：氯仿-甲醇-水（65：35：10，下層）正丁醇-醋酸乙酯-水（4：1：5，上層）黃酮苷：醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10：1：1：1）糖：正丁醇-冰醋酸-水（4：1：5，上層）,中等極性：甲苯-醋酸乙酯-甲酸（10：3：0.5),68,苯—醋酸乙酯—甲醇—異丙醇—濃氨水（6：3：1.5：1.5：0.5）,例：,69,1、定位方法

31、：日光檢視,4.檢 測,熒光淬滅斑點(diǎn),2.紫外光下檢視（254 nm、365nm ）,70,3、顯色檢視：利用顯色劑與待測物質(zhì)反應(yīng)，從而顯色。,顯色劑分類：通用型顯色劑和專屬型顯色劑通用型顯色劑：對大部分物質(zhì)均顯色的試劑。如碘、硫酸乙醇等專屬型顯色劑：對某個或某一類化合物顯色的試劑。如茚三酮 ，三氯化鐵乙醇液等,71,常用顯色劑,10%硫酸乙醇溶液 5%三氯化鐵乙醇液（酸性）：酚,生物堿：改良碘化鉍鉀,黃酮：5%

32、三氯化鋁乙醇液,蒽醌：氨氣,揮發(fā)油及低極性分子： 5%香草醛硫酸液,72,五、薄層色譜法的應(yīng)用,定性分析限量分析含量測定：洗脫測定法 薄層掃描法,73,依據(jù)：固定色譜條件下，相同物質(zhì)的Rf值相同,對照品供試品,定性分析,74,限量檢查,如：附子中烏頭堿的限量檢查,1. 烏頭堿對照品2，3，4. 樣品,75,定量分析,一、冼脫法二、薄層掃描法（TLCS）,76,薄層掃描法,定義：將一定波長

33、的單色光照射展開后的薄層板，測定薄層色譜斑點(diǎn)的吸收度，根據(jù)其色譜峰積分面積與待測物濃度或量成正比的定量方法,,,77,常用：CS-9000雙波長飛點(diǎn)掃描儀 CAMAG SCANNER Ⅲ,儀器結(jié)構(gòu)：,78,1. 基本原理：,折射光吸光度,反射光吸光度：,79,2. 掃描條件的選擇,1）光學(xué)模式的選擇反射法：測量的是反射光的強(qiáng)度透射法：測量的是透射光的強(qiáng)度,2）波長模式的選擇單波長模式：使用一種波長的光束對薄

34、層進(jìn)行掃描。分為單光束及雙光束兩種形式。,80,單光束單波長系統(tǒng),檢測器,缺點(diǎn)：掃描結(jié)果受光源穩(wěn)定性和薄層質(zhì)量（均勻性）的影響,81,雙光束單波長系統(tǒng),,優(yōu)點(diǎn)：有利于補(bǔ)償由光源不穩(wěn)定引起的誤差缺點(diǎn)：對板層不均勻造成的干擾不起作用,82,雙波長系統(tǒng),,優(yōu)點(diǎn)：克服背景不均勻引起的干擾缺點(diǎn)：對光源不穩(wěn)定造成的干擾則無作用,雙波長模式：采用的是兩種不同波長的光束,83,雙波長模式中波長的選擇：測定波長：常選擇斑點(diǎn)化合物的最大吸收波長參比

35、波長：常選擇斑點(diǎn)化合物無吸收的波長,84,3）掃描模式的選擇：（1）直線式掃描：掃描過程中，照射在薄層板的光束在板上作直線運(yùn)動,光束足夠大。,適用范圍： 均勻分布的規(guī)則斑點(diǎn)缺點(diǎn)：光束掃描方向不同，測得的吸收值將會不同,85,（2）鋸齒式掃描（“飛點(diǎn)”式掃描）：掃描過程中，照在薄層板上的光束在薄板上作鋸齒形運(yùn)動。光束微小,適用：斑點(diǎn)的形狀不規(guī)則，濃度分布不均勻,優(yōu)點(diǎn)：掃描測定值不受掃描方向和斑點(diǎn)形狀、濃度分布的影響，結(jié)果穩(wěn)定,86,3

36、. 定量分析方法通常使用隨行標(biāo)準(zhǔn)、外標(biāo)兩點(diǎn)法定量測定。目的：克服板間誤差，提高定量分析的準(zhǔn)確度。,87,外標(biāo)兩點(diǎn)法：對照品兩種不同的量,m樣=a+b A樣,88,第6節(jié) 紙色譜法,1、載體：紙 固定相：纖維素結(jié)合的水，屬正相分配色譜 展開劑：有機(jī)溶劑（正丁醇）,2、適用：極性化合物（多糖）,3. 操作方法：與TLC相同,定義：以濾紙作為載體，以纖維素所結(jié)合的水分為固定液，以有機(jī)溶機(jī)為展開劑的色譜分析法。,