氣相色譜法在中國(guó)藥典中的應(yīng)用

1、氣相色譜法（GC）在2019版《中國(guó)藥典》中的應(yīng)用,孫仁爽單位：通化師范學(xué)院電話：13624355398 QQ：804590217,一、氣相色譜儀的配置,氣源的配置配FID檢測(cè)器需購(gòu)買(mǎi)N2、H2和Air三種氣體。提供氣體兩種方式：鋼瓶（需提前準(zhǔn)備好）和氣體發(fā)生器（購(gòu)買(mǎi)儀器的時(shí)候從廠家訂購(gòu)）。鋼瓶純度高，但氫氣鋼瓶易泄露發(fā)生危險(xiǎn)，可購(gòu)買(mǎi)氫氣報(bào)警器或放室外小房子。發(fā)生器氣體純度稍低，安全性高。通化購(gòu)買(mǎi)不到高純氣體，一般到長(zhǎng)春購(gòu)

2、買(mǎi)。標(biāo)配為氮?dú)庥娩撈?，氫氣和空氣用發(fā)生器。目前有氮?dú)淇找惑w機(jī)，F(xiàn)ID和TCD可滿足要求，ECD達(dá)不到要求。氣體凈化裝置：脫氧管、脫水管、脫烴管。進(jìn)樣系統(tǒng)：包括樣品引入裝置和氣化室（進(jìn)樣口）。 樣品引入裝置：10uL微量注射器、自動(dòng)進(jìn)樣器和頂空進(jìn)樣器（做溶劑殘留、樹(shù)脂殘留需配置）。 進(jìn)樣口：標(biāo)配為前進(jìn)樣口為填充柱進(jìn)樣口、后進(jìn)樣口為分流／不分流進(jìn)樣口。,柱子的選擇（填充柱和毛細(xì)管柱） 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)要求購(gòu)買(mǎi)

3、，購(gòu)買(mǎi)的時(shí)候明確柱子型號(hào)最好，毛細(xì)管柱主要為聚硅氧烷類(lèi)和聚乙二醇類(lèi)。開(kāi)發(fā)新方法時(shí)，首選非極性固定相，柱效高，對(duì)氧不敏感、最高使用溫度高、柱壽命長(zhǎng)優(yōu)點(diǎn)。檢測(cè)器 標(biāo)配為ＦIＤ（大多數(shù)有機(jī)化合物）/TCD（微量水分測(cè)定）和ＥCD（有機(jī)氯農(nóng)殘）。氮磷檢測(cè)器（有機(jī)磷農(nóng)藥殘留方法已被05藥典附錄收載，但具體品種的檢驗(yàn)尚未開(kāi)展）工作站：廠家自帶工作站，可要求廠家安裝。N2000。通化師范學(xué)院有氣相、頂空、分流、農(nóng)殘檢測(cè)器，藥典標(biāo)準(zhǔn)要求的

4、氣相條件已完全具備，可以委托做樣和開(kāi)發(fā)方法。,儀器標(biāo)準(zhǔn)配置,氣源：氮?dú)怃撈?、氫氣發(fā)生器和空氣發(fā)生器。凈化裝置：無(wú)ECD可不配。進(jìn)樣口：填充柱進(jìn)樣口和分流/不分流進(jìn)樣口樣品引入裝置：手動(dòng)進(jìn)樣器（10uL）和頂空進(jìn)樣器柱子：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)要求。檢測(cè)器：FID和ECD（農(nóng)殘）工作站：廠家工作站或N2000,需要購(gòu)買(mǎi)儀器的情況無(wú)氣相色譜儀：一般為委托檢驗(yàn)。 建議：根據(jù)樣品和藥典、局頒標(biāo)準(zhǔn)和企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)按標(biāo)配配齊，節(jié)省成本。現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)無(wú)

5、法滿足標(biāo)準(zhǔn)要求如有GC，未配置分流不分流進(jìn)樣口和頂空、ECD， 建議：對(duì)儀器進(jìn)行升級(jí)。任務(wù)重，GC不夠用。建議：買(mǎi)同型號(hào)（可替換）或不同型號(hào)（方法學(xué)驗(yàn)證）均可。,二、合格的GC操作者應(yīng)具備的知識(shí),1. 保管好安裝光盤(pán)和說(shuō)明書(shū)，熟悉配件。2.使用純度合乎要求的氣體，防止檢測(cè)器和柱子被污染。 購(gòu)買(mǎi)要告訴氣體生產(chǎn)廠家要五個(gè)9氣體或高純氣體。填充柱以FID為檢測(cè)器也可以用四個(gè)9氣體。氣體剩下0.2Mpa就不要再用，如果有管路泄露或氣

6、體用盡，鋼瓶易被污染，灌裝前需凈化處理，需要幾百元費(fèi)用，而一瓶氣體一般價(jià)值幾百元，因此定期用肥皂水做泄露檢查。,3.使用性能可靠的二級(jí)減壓閥（氧氣表） 。氣體發(fā)生器不需要，一般需藥廠自己準(zhǔn)備好，避免工程師調(diào)試的時(shí)候無(wú)法安裝，要求高，一般在外地購(gòu)買(mǎi)，氧氣表右邊的表顯示鋼瓶氣體壓力，左邊表顯示減壓輸出后氣體壓力。4.定期更換氣體凈化器填料（氣源與儀器之間，配ECD檢測(cè)器最好配置）變色硅膠變紅時(shí)需要活化，140℃加熱2h。分子篩等吸附有機(jī)物

7、的凈化器就不好用肉眼判斷了，須定期更換?？諝鈮嚎s機(jī)有機(jī)雜質(zhì)高一些，最好3個(gè)月更換一次，馬福爐400~600加熱4-6h。,5.會(huì)測(cè)定氣體的流速和計(jì)算分流比 氣體的流速單位一般用mL/min表示，一般用皂膜流量計(jì)測(cè)定。氫氣的流速30-40之間，空氣的流速一般在300-400之間，載氣的流速根據(jù)樣品和色譜柱的種類(lèi)決定，測(cè)完氫氣、空氣、尾吹氣的流速減掉載氣流速。隔膜吹掃（用途）一般是1。尾吹氣（用途）是20-30之間。分流出口流量根據(jù)需

8、要測(cè)定。分流比=（分流出口流量+柱流量）/柱流量。氮?dú)猓簹錃猓嚎諝?1:1:10FID靈敏度最高。6.進(jìn)樣口的維護(hù) 能更換進(jìn)樣口隔墊、清洗進(jìn)樣口襯管（玻璃毛）、襯管上端的O形硅橡膠密封圈、清洗分流平板。,,每6-12個(gè)月或當(dāng)指示型捕集阱顏色改變時(shí)更換時(shí)間取決于捕集阱的容量與氣體純度,每1-2年校準(zhǔn)一次,每3個(gè)月當(dāng)發(fā)現(xiàn)注射器中有明顯的清洗不掉的污染物, 或推桿難以抽動(dòng), 或當(dāng)推桿粘連時(shí), 或進(jìn)樣口隔墊穿刺出現(xiàn)異常, 或當(dāng)針

9、頭被堵塞時(shí),每60針樣品裂口, 進(jìn)樣口襯管內(nèi)有碎屑, 保留時(shí)間偏移, 柱壓降低等等,每月與襯管一起更換, 或視磨損情況更換,每周經(jīng)常檢查, 當(dāng)襯管內(nèi)有可見(jiàn)的污染物或色譜性能下降時(shí)更換,每月經(jīng)常檢查, 當(dāng)有劃痕, 腐蝕或非揮發(fā)性組分造成堵塞, 污染時(shí)更換,每次更換色譜柱, 進(jìn)樣口/檢測(cè)器部件時(shí)更換,GC消耗品更換時(shí)間表,7. 及時(shí)清洗注射器，取樣的時(shí)候會(huì)排氣泡，注射速度越快越好，且每次注射的過(guò)程重現(xiàn)性要好，取樣之前用溶劑洗3次

10、（每次抽滿2/3），樣品溶液洗3次，然后取樣。8. 會(huì)更換柱子（插入進(jìn)樣口和檢測(cè)器的深度，用換下的隔墊插到柱子上。換下的柱子堵上盲堵，第一次沒(méi)有方向，一般讓牌子從正面看到，用過(guò)一次就有方向）。,柱子安裝 進(jìn)樣口端①使色譜柱穿過(guò)墊圈伸出4-6mm，把隔墊向上滑到柱螺帽②將柱插入進(jìn)樣口，把柱上的螺帽和墊圈向上滑到進(jìn)樣口底部，用手?jǐn)Q緊柱螺帽至柱固定，調(diào)節(jié)色譜柱的位置，使柱上隔墊正好在柱螺帽底部③扳手?jǐn)Q緊1/4-1/2圈。 檢測(cè)器

11、一端：將柱螺母和墊圈插入到檢測(cè)器接頭底部，接頭用手?jǐn)Q緊，再將柱子下拉1mm，扳手?jǐn)Q緊-1/4圈，檢漏。（液相柱區(qū)別）,切割柱子、切割銅管，及時(shí)更換毛細(xì)管柱密封墊。安裝完色譜柱做泄露檢查，尤其是連檢測(cè)器的一端。準(zhǔn)備一份色譜柱測(cè)試標(biāo)樣，做柱效測(cè)定，看色譜柱是否合格以及確定問(wèn)題是否在色譜柱。柱子牌子信息：長(zhǎng)度、內(nèi)徑、固定液厚度、溫度范圍。柱子的老化（40℃-50℃/10℃/min→升至最高使用溫度2-3h，不連接檢測(cè)器，不用氫氣作為老化載氣

12、。何時(shí)老化？新柱子和長(zhǎng)時(shí)間未用的柱子或色譜峰異常）。老化目的除去填充物中殘留揮發(fā)性成分，并使固定液再一次均勻牢固地分布在載體表面上。,9.檢測(cè)器的維護(hù) 點(diǎn)火線圈的更換、噴嘴的清洗、注意不要燙傷。開(kāi)機(jī)先開(kāi)載氣，檢測(cè)到柱子流量后再升溫，否則將破壞柱子和檢測(cè)器。FID檢測(cè)器溫度達(dá)到150度才能點(diǎn)火，判斷是否已經(jīng)點(diǎn)著火。關(guān)機(jī)是先關(guān)氫氣和空氣，再降溫度，最后關(guān)載氣（保護(hù)檢測(cè)器和柱子）。熱導(dǎo)檢測(cè)器注意通電之前，確保載氣通過(guò)了檢測(cè)器，否則，錸鎢

13、絲易被燒斷。關(guān)機(jī)先關(guān)檢測(cè)器電源，然后關(guān)載氣。注意錸鎢絲易被氧化。電子捕獲注意放射性危害，不允許自己拆卸，廠家工程師或?qū)I(yè)人員，ECD出口排到室外。,10.會(huì)數(shù)據(jù)處理內(nèi)標(biāo)法（內(nèi)標(biāo)校正因子法和內(nèi)標(biāo)工作曲線法） 可消除進(jìn)樣量不準(zhǔn)確誤差，GC進(jìn)樣量一般為1uL，液相是10uL、20uL，GC更易出現(xiàn)進(jìn)樣誤差，自動(dòng)進(jìn)樣器準(zhǔn)確度可滿足要求，手動(dòng)進(jìn)樣最好用內(nèi)標(biāo)法定量。需要內(nèi)標(biāo)物。,,廣藿香,注意結(jié)果要求：mg/g、每片含、標(biāo)示百分含量,,對(duì)照品

14、溶液得標(biāo)準(zhǔn)曲線AR/AS=aCR+b，將Ai/As代入曲線計(jì)算。得標(biāo)準(zhǔn)曲線：工作站、計(jì)算器、EXCEL,外標(biāo)法（外標(biāo)一點(diǎn)法和工作曲線法）,面積歸一化法,粗略考察，需全部出峰且都被檢測(cè)到，溶劑峰去掉，不易用于微量雜質(zhì)的檢查，一般用于同系物的含量測(cè)定。,硬脂酸鎂中硬脂酸含量、大豆油（供注射用）,標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法（頂空進(jìn)樣）頂空中供試品和對(duì)照品處于不相同基質(zhì)中，如有不同，加入法為準(zhǔn),配置適當(dāng)濃度對(duì)照品溶液（0.5mg/ml），取一定量（2m

15、L）加入到供試品溶液（8mL）中，對(duì)照品加入前后各進(jìn)樣2uL。Ax=40，Ais=60。,三、15版藥典的總體構(gòu)想,將凡例、附錄（制劑通則、通用分析方法、指導(dǎo)原則）、藥用輔料整合成公共部分，稱(chēng)為總則。藥品正文保留一部、二部、三部。一部分為上下兩卷，上卷收載藥材、飲片、植物油脂與提取物；下卷收載成方制劑。將應(yīng)用廣泛、成熟的相關(guān)測(cè)定方法，以附錄形式收入中藥一部。如黃芩苷、芍藥苷升格為附錄。二部為化學(xué)藥三部為生物制品,解決系列品種多

16、標(biāo)準(zhǔn)并列問(wèn)題。合并同類(lèi)項(xiàng)，建立系列品種的通用標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)一鑒別、檢查、含量測(cè)定如六味地黃系列、藿香正氣系列。15版藥典原則上不再收載新方法，主要加強(qiáng)10版新收載方法的推廣。如一測(cè)多評(píng)、特征圖譜和指紋圖譜、DNA分子鑒定、薄層生物自顯影技術(shù)等。重視引導(dǎo)、推廣、支持國(guó)產(chǎn)檢驗(yàn)儀器的發(fā)展和應(yīng)用，開(kāi)展了國(guó)產(chǎn)儀器驗(yàn)證工作（與國(guó)外對(duì)比試驗(yàn)，進(jìn)行重復(fù)性、檢測(cè)限等）。檢測(cè)限(與靈敏度區(qū)別)和定量限的計(jì)算。如進(jìn)一個(gè)濃度0.1ug/mL的對(duì)照品溶液，得到該組

17、分的信噪比為60:1，檢測(cè)限為3倍信噪比，定量限為10倍信噪比。按照藥典勘誤改正藥典。,四、執(zhí)行藥典之配套及參考圖書(shū),《中國(guó)藥典》英文版《中國(guó)藥典注釋》90版有，10版即將出版。《臨床用藥須知》《中國(guó)藥典中藥材粉末顯微鑒別圖鑒》《中國(guó)藥典中藥薄層色譜圖集》《中國(guó)藥典中藥材及原植物彩色圖鑒》《中藥飲片炮制規(guī)范》，15年《全國(guó)中藥飲片炮制規(guī)范》,五、GC法在2019版《中國(guó)藥典》中的應(yīng)用,凡例：藥典凡例第十條關(guān)于溶劑殘留。正

18、文一部中藥材與飲片：冰片中龍腦含量、農(nóng)藥殘留（甘草、黃芪）植物油脂和提取物：三七三醇皂苷的樹(shù)脂殘留、燈盞花素溶劑殘留、滿山紅油特征圖譜 、薄荷素油指紋圖譜 中成藥：西瓜霜潤(rùn)喉片冰片、小兒感冒口服液百秋李醇,冰片（合成龍腦）,本品含龍腦不得少于55.0%,滿山紅油特征圖譜 從中藥指紋圖譜中選取若干專(zhuān)屬性強(qiáng)的色譜峰組成特征指紋圖譜，用于中藥的專(zhuān)屬性鑒別。,薄荷素油指紋圖譜,斜率靈敏度：平直的色譜基線其斜率為0，當(dāng)出現(xiàn)色譜峰時(shí)斜

19、率會(huì)快速增大，當(dāng)斜率大于或等于設(shè)定值，積分儀就認(rèn)為是出峰了，便開(kāi)始積分。當(dāng)斜率由正變負(fù)，即為色譜峰的最大值即峰高。峰出完后，斜率的絕對(duì)值變小，低于設(shè)定值時(shí)，積分儀認(rèn)為峰結(jié)束，停止積分。峰寬：設(shè)定采集數(shù)據(jù)速率的。峰寬設(shè)定越小，采集速率越快。對(duì)于很窄的峰，采集速率應(yīng)足夠快，否則會(huì)使峰形畸變，甚至丟失；對(duì)于很寬的峰，采集速率可慢一些。否則信號(hào)的微小波動(dòng)也作為峰處理，將峰分裂為幾個(gè)峰。最小峰高：符合斜率標(biāo)準(zhǔn)，信號(hào)大于最小峰高時(shí)開(kāi)始積分。閥值

20、越大，色譜峰開(kāi)始積分點(diǎn)推后，結(jié)束點(diǎn)越提前。最小峰面積：當(dāng)積分結(jié)束后，某一色譜峰是否參與最后的計(jì)算，取決于最小峰面積的設(shè)定值。,前三個(gè)決定積分的準(zhǔn)確性。三者要相互配合。 如基線噪聲大而色譜峰也都較大時(shí)，斜率的設(shè)置難以有效除去噪聲，將峰寬或最小峰高設(shè)大一些。對(duì)很小的色譜峰積分時(shí)，將最小峰高設(shè)小一些，峰寬設(shè)大一些，色譜峰一般比基線噪聲的寬度大。 程序升溫分析時(shí)，高溫下基線會(huì)出現(xiàn)不同程度的漂移，將斜率設(shè)大一些，避免誤將基線漂移作為

21、峰來(lái)處理。 最小峰面積積分后計(jì)算時(shí)才使用，對(duì)于歸一化法要注意最小峰面積的設(shè)定。,中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng),本軟件系統(tǒng)包括兩個(gè)應(yīng)用版本：研究版（2019 A）和檢驗(yàn)版（2019 B）。研究版主要用于科學(xué)研究工作，具有生成對(duì)照?qǐng)D譜功能。檢驗(yàn)版?zhèn)戎赜谏V指紋圖譜的檢驗(yàn)工作，功能簡(jiǎn)化，不具有生成對(duì)照?qǐng)D譜的功能。本系統(tǒng)支持三種格式文件的導(dǎo)入：AIA(即*.cdf)文件，文本文件（*.txt）和Scp(*.Scp)格式文件的導(dǎo)入。建議

22、采用通用的AIA（*.cdf）格式文件導(dǎo)入。注意AIA（*.cdf）文件中應(yīng)包含樣本圖譜的峰面積信息，在色譜工作站導(dǎo)出AIA（*.cdf）文件前應(yīng)現(xiàn)進(jìn)行積分。否則導(dǎo)出的AIA（*.cdf）文件可能因不包含峰面積信息而無(wú)法導(dǎo)入。 文件導(dǎo)入→設(shè)參照?qǐng)D譜→自動(dòng)匹配→對(duì)照?qǐng)D譜生成→相似度評(píng)價(jià)→打印報(bào)告如需要開(kāi)發(fā)指紋圖譜的新方法和進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)可以免費(fèi)代做。,二部 乙醇中揮發(fā)性雜質(zhì)的檢查(藥典勘誤)、 明膠空心膠囊中氯乙醇和環(huán)氧

23、乙烷的檢查、吐溫類(lèi)、聚乙二醇類(lèi)的雜質(zhì)檢查、纖維素類(lèi)甲氧基、乙氧基和羥丙氧基、丙二醇中有關(guān)物質(zhì)的檢查、溶劑殘留檢查。,明膠空心膠囊（腸溶明膠空心膠囊）的限量檢查,氯乙醇為空心膠囊用環(huán)氧乙烷消毒過(guò)程衍生的有機(jī)物質(zhì)，為親肝性毒物，沸點(diǎn)128-130℃。,C=2ug/mL V=1mL S=2.0g,附錄制劑通則：流浸膏、藥酒、酊劑的乙醇、藥酒和口服酊劑的甲醇檢查。通用檢測(cè)方法：乙醇量檢查法甲醇量檢查法水分測(cè)定法第四法-

24、氣相色譜法（一部）溶劑殘留檢查法農(nóng)藥殘留檢查法桉油精含量測(cè)定方法甲氧基、乙氧基和羥丙氧基測(cè)定法,附錄IX M 乙醇量測(cè)定法（蒸餾法與GC法不一致，以后者為準(zhǔn)）,以正丙醇為內(nèi)標(biāo)物(在不含內(nèi)標(biāo)物的供試品溶液中，內(nèi)標(biāo)物的位置不得出現(xiàn)雜質(zhì)峰)，F(xiàn)ID測(cè)定各種制劑（藥酒、酊劑、流浸膏劑）在20℃時(shí)乙醇的含量（%）（mL/mL ）。如藿香正氣水[檢查]乙醇量應(yīng)為40-50%（附錄IX M）,標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備量取恒溫至20℃無(wú)水乙醇4、5

25、、6mL，置100mL量瓶中，分別精密加入恒溫至20℃ 正丙醇5mL，加水定容。進(jìn)樣得校正因子。(CR=4%、5%、6%，CS=5%)供試品溶液的制備 量取恒溫至20℃的供試品（約相當(dāng)于乙醇5mL，如藿香正氣水含40-50%，10 mL）置100mL量瓶中，分別精密加入恒溫至20℃ 正丙醇5mL，加水定容，進(jìn)樣測(cè)含量。 （C‘S=5%)注意：毛細(xì)管柱法稀釋100倍后進(jìn)樣。計(jì)算過(guò)程一樣。,系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn),毛細(xì)管法（INNOW

26、AX，0.53mm，氣液色譜）上述3份標(biāo)準(zhǔn)溶液各進(jìn)樣3次，9個(gè)校正因子RSD≤2.0%，塔板數(shù)正丙醇≥8000，Rs ≥2.0(出現(xiàn)峰形變差可提高柱溫老化柱子)填充柱法（GDX，2m，氣固色譜）塔板數(shù)正丙醇≥700（如不滿足，改變進(jìn)樣口、柱、檢測(cè)器溫度）規(guī)定:重復(fù)性（內(nèi)標(biāo)）-80%、100%、120%，至少做2次，校正因子RSD≤2.0%。 (外標(biāo))-同一溶液進(jìn)5次。,各品種項(xiàng)下規(guī)定的

27、色譜條件，除檢測(cè)器種類(lèi)、固定液品種及特殊指定的色譜柱材料不得改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長(zhǎng)度、載體牌號(hào)、粒度、固定液涂布濃度、載氣流速、柱溫、進(jìn)樣量、檢測(cè)器的靈敏度等，均可適當(dāng)改變，以適應(yīng)系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)的要求。,補(bǔ) 充,為滿足系統(tǒng)適用性要求，有時(shí)需要調(diào)整流動(dòng)相組分的比例。以組分比例較低者(小于或等于50%)相對(duì)改變量不超過(guò)±30%且絕對(duì)改變量不超過(guò)±10%為限，如30%相對(duì)改變量的數(shù)值超過(guò)10%時(shí)，則改變量以10%為

28、限。二元流動(dòng)相系統(tǒng)50：50 50%的最大相對(duì)改變量為15%，已超過(guò)了絕對(duì)改變量允許的范圍，比例調(diào)節(jié)的范圍是±10%，即40：60至60：40。2：98 2%的最大相對(duì)改變量為0.6%，比例調(diào)節(jié)的范圍是1.4：98.6至2.6：97.4,三元流動(dòng)相系統(tǒng)（60：35：5） 可每次調(diào)節(jié)比例較低的兩個(gè)組分。 對(duì)于35%的組分，其最大相對(duì)改變量為10.5%，已超過(guò)了絕對(duì)改變量允許的范圍，故該組分

29、比例調(diào)節(jié)的范圍是±10%，即25%-45%，則流動(dòng)相系統(tǒng)比例的調(diào)節(jié)范圍是50：45：5至70：25：5 對(duì)于5%的組分,其最大相對(duì)改變量為1.5%,該組分比例調(diào)節(jié)的范圍是±1.5%，即3.5%-6.5%，則流動(dòng)相系統(tǒng)比例的調(diào)節(jié)是58.5：35：6.5至 61.5：35：3.5,結(jié)果判斷,測(cè)2份供試品溶液，RDS≤2.0%，否則應(yīng)重新測(cè)定。根據(jù)測(cè)定結(jié)果的平均值判斷是否符合規(guī)定，不符合應(yīng)復(fù)測(cè)。,附錄IN 甲醇量測(cè)定法（

30、酒劑、口服酊劑）藿香正氣水[檢查]其它-應(yīng)符合酊劑下有關(guān)的各項(xiàng)規(guī)定（附錄IN ）,柱子同乙醇量測(cè)定法毛細(xì)管柱用頂空進(jìn)樣，外標(biāo)法計(jì)算含量。填充柱用手動(dòng)進(jìn)樣，內(nèi)標(biāo)法計(jì)算含量，內(nèi)標(biāo)物相應(yīng)位置出現(xiàn)雜質(zhì)峰，改用外標(biāo)法。計(jì)算注意最后濃度的換算供試品溶液的制備：取內(nèi)標(biāo)1mL置10mL容量瓶中，加供試品溶液定容。結(jié)果判斷：兩次測(cè)定結(jié)果RSD≤10%,否則應(yīng)重新測(cè)定。根據(jù)測(cè)定結(jié)果的平均值判斷是否符合規(guī)定，除另有規(guī)定外，甲醇量≤0.05%。,附

31、錄IX H水分測(cè)定法第四法氣相色譜法,以純化水為對(duì)照，無(wú)水乙醇為溶劑，熱導(dǎo)檢測(cè)器（TCD），測(cè)定貴重藥材及其制劑中的含水量。色譜柱：高分子多孔小球填充柱。（可改用毛細(xì)管柱，系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)須滿足要求）,對(duì)照品溶液的制備取純化水約0.2g，置25mL量瓶中加無(wú)水乙醇定容。供試品溶液的制備 取供試品適量（含水量約0.2g），置錐形瓶中加無(wú)水乙醇50mL，密塞（防空氣中水分進(jìn)入），超聲，傾取上清液。測(cè)定 取無(wú)水乙醇、對(duì)照溶液和

32、供試品溶液各1-5微升。先計(jì)算K值外標(biāo)法計(jì)算供試品水分，扣除無(wú)水乙醇的含水量。,高分子多孔微球（GDX）屬于氣固色譜。用于分離水及含羥基（醇）化合物和永久性氣體如H2、O2、N2等。GDX由苯乙烯和二乙烯基苯共聚而成，屬于非極性固定相，分析醇、醛、水和其它短鏈極性化合物，可得到對(duì)稱(chēng)的色譜峰。它對(duì)含OH化合物的親和力很弱，可使水在有機(jī)化合物出峰之前出峰，而所得水峰對(duì)稱(chēng)，適合有機(jī)溶劑中痕量、微量水的測(cè)定。永久性氣體在氣液色譜中

33、不能分離，在固定液中溶解度極小，分配系數(shù)幾乎相同而固體吸附劑對(duì)永久性氣體有好的吸附能力。,附錄IX Q 農(nóng)藥殘留量測(cè)定法（痕量）用GC法測(cè)定藥材（甘草、黃芪）、飲片、制劑中有機(jī)氯、有機(jī)磷、擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥。,難點(diǎn),痕量分析，要求極高的檢測(cè)靈敏度。中藥樣品種類(lèi)各異，基體成分復(fù)雜 高、中等含水量的樣品（提取加無(wú)水NaSO4） 根和鱗莖類(lèi)：甘草、貝母 葉綠素含量低：豆蔻、陳皮

34、 葉綠素含量高：大青葉、薄荷 含糖量高的樣品：枸杞、麥冬（提取加水） 含脂肪高的樣品：酸棗仁 對(duì)試驗(yàn)操作、儀器操作技術(shù)要求高 硬件條件和檢測(cè)成本較高 毒性強(qiáng)，檢測(cè)風(fēng)險(xiǎn)大,農(nóng)藥的分類(lèi),按照用途：殺蟲(chóng)劑、殺螨劑、殺菌劑、除草劑、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等。按照結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 礦物類(lèi)農(nóng)藥-無(wú)機(jī)化合物：有機(jī)氯、有機(jī)磷、氨基甲酸酯類(lèi) 化學(xué)合成農(nóng)藥-有機(jī)化合物：擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)

35、 生物類(lèi)農(nóng)藥-天然有機(jī)物（有機(jī)氮類(lèi)）、抗生素（雜環(huán)類(lèi)）、生物類(lèi)農(nóng)藥（有機(jī)金屬類(lèi)） 世界上正使用的農(nóng)藥超過(guò)750種，對(duì)人類(lèi)健康造成巨大威脅-農(nóng)殘分析日益受到重視。,農(nóng)殘分析的一般程序,樣品收集：采樣具科學(xué)性、代表性前處理：預(yù)處理（粉碎）-提?。ǔ曁崛?，不單獨(dú)采用非極性溶劑，常與極性溶劑合用或用極性溶劑如70%丙酮、乙酸乙酯、石油醚-丙酮）-凈化（磺化法、液液分配法、低溫冷凍法、柱層析法）-濃縮（真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法、氮

36、吹儀、自然揮發(fā)法）儀器分析： GC-ECD、NPD、FPD(70%以上) GC/MS-EI、CI HPLC-UV、DAD、FLD（氨基甲酸酯類(lèi)）,一、有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量測(cè)定法,六六六（4 種）、DDT （4 種）、五氯硝基苯 有機(jī)氯農(nóng)藥是農(nóng)藥中使用量最大，使用歷史最長(zhǎng)的一類(lèi)農(nóng)藥，性質(zhì)穩(wěn)定，殘效期長(zhǎng)（達(dá)30~50年），易在脂肪組織中蓄積，造成慢性中毒。2000版中國(guó)藥典開(kāi)始收載有機(jī)氯農(nóng)藥。 儀器：GC、手動(dòng)進(jìn)樣

37、器、ECD、載氣為高純氮（安脫氧管）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（負(fù)壓液體沸點(diǎn)降低）、柱子：SE-54（弱極性）、DB-1701（中等極性）毛細(xì)管柱，均為不分流進(jìn)樣（0.75min）和程序升溫，二者進(jìn)樣口和柱溫不同。試劑：農(nóng)殘級(jí)試劑或分析純重蒸餾。,注意：只有分流進(jìn)樣靈敏度達(dá)不到要求才采用不分流進(jìn)樣。分流不分流采用的是同一個(gè)進(jìn)樣口。時(shí)間設(shè)置90-120s，保證全部組分進(jìn)入色譜柱，選擇一個(gè)待測(cè)組分的峰面積為指標(biāo)，該面積代表100%進(jìn)入了色譜柱。然后

38、逐步縮短不分流時(shí)間如70、50、30s分別進(jìn)樣分析，計(jì)算與第一次的峰面積比值只到小于0.95.95%-99%為最佳吹掃時(shí)間。對(duì)照品儲(chǔ)備液：分別制成4-5ug/mL?；旌蠈?duì)照品儲(chǔ)備液：稀釋20倍?；旌蠈?duì)照品溶液：石油醚（60-90℃）制成0、1、5、10、50、100、250ug/L。 7個(gè)濃度均做，最后用與樣品面積最接近那個(gè)濃度按外標(biāo)法計(jì)算含量。,總BHC 、總DDT低于千萬(wàn)分之二，PCNB低于千萬(wàn)分之一,70%丙酮超聲

39、提取，二氯甲烷、丙酮/水液液萃取，濃硫酸進(jìn)行磺化處理，利用脂肪、蠟質(zhì)等雜質(zhì)與濃硫酸磺化生成極性大的物質(zhì)與農(nóng)藥分離。對(duì)易分解或發(fā)生反應(yīng)的有機(jī)磷、氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥不可使用。注意加入硫酸后量取的上清液要用水洗，除盡硫酸，減少對(duì)儀器和柱子的破壞。 加氯化鈉后應(yīng)充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙?，使二氯甲烷、丙?水溶液徹底分層，不加氯化鈉三者不分層。,無(wú)水硫酸鈉目的是除去水分，不可以用太多，一般為5-6g，否則會(huì)影響回收率。補(bǔ)足重量為部分取樣法，完全取樣

40、法一般為回收溶劑定容。近干一般為剩下一滴，不要全干，避免農(nóng)藥損失。氮吹儀濃縮農(nóng)藥損失率低，但溶劑處理量小。實(shí)驗(yàn)用器皿應(yīng)嚴(yán)格清洗，不能殘存鹵素離子。操作應(yīng)避光，光線使許多農(nóng)藥降解。,二、有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量測(cè)定法,有機(jī)磷農(nóng)藥具有毒性，其殘留嚴(yán)重危及人體健康。2019中國(guó)藥典一部收載12種有機(jī)磷農(nóng)藥測(cè)定方法。色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)  彈性石英毛細(xì)管柱(30m×0.25mm×0.25μm)DB-17MS(或

41、HP-5)，氮磷檢測(cè)器（NPD）。進(jìn)樣口溫度230℃；檢測(cè)器溫度300℃，不分流進(jìn)樣。程序升溫：初始120℃，每分鐘10℃升至220℃，每分鐘5℃升至240℃，保持2分鐘，每分鐘20℃升至270℃，保持0.5分鐘。理論板數(shù)按敵敵畏峰計(jì)算不低于6000，兩個(gè)相鄰色譜峰的分離度應(yīng)大于1.5。,對(duì)照品儲(chǔ)備液制備    稱(chēng)取對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷、樂(lè)果、氧化樂(lè)果、甲胺磷、久效磷、二嗪農(nóng)、乙硫磷、馬拉硫磷、殺撲磷、敵敵畏

42、、乙酰甲胺磷農(nóng)藥對(duì)照品適量，用乙酸乙酯分別制成約100ug/mL的溶液?；旌蠈?duì)照品儲(chǔ)備液的制備  量取上述各對(duì)照品儲(chǔ)備液1ml，置20ml棕色量瓶中,加乙酸乙酯定容。混合對(duì)照品溶液的制備  精密量取上述混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，用乙酸乙酯制成每 1mL含0.1μg、0.5μg、1μg、2μg、5μg的溶液，即得。,供試品溶液制備    取供試品約5g，加無(wú)水硫酸鈉5g，加入乙酸乙酯50~100ml，冰

43、浴超聲處理3分鐘，放置，取上層液濾過(guò)。取濾液于40℃以下減壓濃縮至近干，用乙酸乙酯轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，并稀釋至刻度，精密量取1ml，置活性炭小柱（乙酸乙酯5ml預(yù)洗），置真空樣品處理器上，用正己烷-乙酸乙酯（1：1）混合液5ml洗脫，收集洗脫液，置氮吹儀上濃縮至近干，加入乙酸乙酯1ml使溶解。測(cè)定及結(jié)果計(jì)算 進(jìn)1uL對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別進(jìn)樣3次，取平均值，外標(biāo)法計(jì)算12種有機(jī)磷含量。,5.1×1000,,

44、15;100%,玻璃儀器不能用含磷洗滌劑洗滌，應(yīng)用洗液浸泡洗滌，使用前用丙酮蕩洗并揮干溶劑。無(wú)水硫酸鈉脫水，劇烈振搖后如有固體硫酸鈉存在，說(shuō)明所加無(wú)水硫酸鈉已夠。國(guó)際上多用乙腈作為有機(jī)磷農(nóng)藥的提取試劑及分配凈化試劑，但其毒性較大，用乙酸乙酯。一般提取3次。冷凍法使藥材中蠟質(zhì)等沉淀析出，而農(nóng)藥留在溶液中，超聲時(shí)候加冰塊，溫度高有機(jī)磷損失?；钚蕴繉?duì)植物色素有很強(qiáng)的吸附作用。,擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥殘留量測(cè)定,與DDT同屬軸突毒劑，中毒癥狀

45、相似。菊酯類(lèi)毒理作用迅速，危害人體健康。10版收載三種。三類(lèi)農(nóng)藥都是神經(jīng)毒劑，阻斷神經(jīng)傳導(dǎo)，不直接殺死神經(jīng)細(xì)胞。色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)    彈性石英毛細(xì)管柱（30m*0.32mm*0.25um)SE-54(或 DB-5），63Ni-ECD電子捕獲檢測(cè)器。進(jìn)樣口溫度270℃，檢測(cè)器溫度330℃。分流 比20：1；5：1（或根據(jù)儀器設(shè)置選擇最佳的分流比）。程序升溫。,對(duì)照品貯備液的制備 

46、0; 稱(chēng)取氯氰菊酯、氰戊菊酯及溴氰菊酯農(nóng)藥對(duì)照品適量，用石油醚（60~90℃）分別制成約20~25ug/ml的溶液。  混合對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備   精密量取上述各對(duì)照品儲(chǔ)備液1ml，置10ml量瓶中， 用石油醚稀釋至刻度。  混合對(duì)照品溶液的制備   精密量取上述混合對(duì)照品貯備液，用石油醚稀釋制成每1L分別含0ug、4ug、8ug、40ug、200ug的溶液，即得。,供試品

47、溶液的制備      取供試品于60℃干燥4小時(shí)，粉碎成細(xì)粉，取約1~2g，精密稱(chēng)定，置100ml具塞錐形瓶中，加石油醚（60~90℃）-丙酮（ 4：1）混合溶液30ml，超聲處理15分鐘，濾過(guò)，藥渣再重復(fù)上述操作2次后，合并濾液。濾液加入適量無(wú)水硫酸鈉脫水后，于40~45℃減壓濃縮至近干，用少量石油醚反復(fù)操作至丙酮除凈，殘?jiān)舆m量石油醚溶解，置 混合小柱［從下至上依次為無(wú)水硫酸鈉2g、弗羅里硅土

48、4g（祛除色素）、微晶纖維素1g、氧 化鋁1g（除糖苷類(lèi)）、無(wú)水硫酸鈉2g］上，用石油醚-乙醚（4：1）混合溶液90ml洗脫，收集洗脫液，于40~45 ℃減壓濃縮至近干，再用石油醚3~4ml重復(fù) 操作至乙醚除凈，用石油醚溶解轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，并定容。,,1.8×1000,×100%,測(cè)定法  分別精密吸取供試品溶液和與之相對(duì)應(yīng)濃度的混合對(duì)照品溶液各1ul，分別連續(xù)進(jìn)樣3次，取3次平均值，按外標(biāo)法計(jì)算供試品

49、中3種擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥殘留量。,殘留溶劑測(cè)定法,藥典凡例第十條：對(duì)于生產(chǎn)過(guò)程中引入的有機(jī)溶劑，應(yīng)在后續(xù)的生產(chǎn)環(huán)節(jié)予以有效去除。除正文已明確列有“殘留溶劑”檢查的品種必須依法進(jìn)行該項(xiàng)檢查外，其他未在“殘留溶劑”項(xiàng)下明確列出的有機(jī)溶劑與未在正文中列有此項(xiàng)檢查的各品種，如生產(chǎn)過(guò)程中引入或產(chǎn)品中殘留有機(jī)溶劑，均應(yīng)按附錄“殘留溶劑測(cè)定法”檢查并應(yīng)符合相應(yīng)溶劑的限度規(guī)定。,藥物中的殘留溶劑指在原料藥或輔料的生產(chǎn)中，以及制劑制備過(guò)程中使用的，但在工藝過(guò)

50、程中未能完全去除的有機(jī)溶劑。 2019版中國(guó)藥典參考了國(guó)際協(xié)調(diào)大會(huì)（ICH）頒布的殘留溶劑研究指導(dǎo)原則，所監(jiān)測(cè)的四類(lèi)有機(jī)溶劑和限量值見(jiàn)限度標(biāo)準(zhǔn)一覽表。中國(guó)藥典的限量要求與日本藥典、美國(guó)藥典（USP 467）歐洲藥典（EP）中的規(guī)定基本相同。,儀器：GC、頂空進(jìn)樣裝置,供試品中殘留溶劑種類(lèi)的確定,進(jìn)甲烷氣體做為色譜的死時(shí)間t0稱(chēng)取丁酮，溶劑稀釋作為內(nèi)標(biāo)溶液。稱(chēng)取供試品，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋成0.1-0.5g/mL的供試品溶液。采用推

51、薦的程序升溫法，在SPB-1和HP-INNOWAX測(cè)定，時(shí)間窗為5%。,供試品溶液的制備 頂空進(jìn)樣：供試品常以水為溶劑，對(duì)于非水性藥物，用N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜。 溶液直接進(jìn)樣對(duì)照品溶液的制備制備同上，濃度應(yīng)注意：限度檢查-根據(jù)殘留溶劑的限度確定對(duì)照品溶液濃度；含量測(cè)定-根據(jù)樣品中實(shí)際殘留量，A對(duì)照品≤2倍供試品A色譜峰,測(cè)定法,消旋卡多曲原料藥有機(jī)殘留檢驗(yàn)方法改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方案公司現(xiàn)行方法：氯

52、仿和二氯甲烷由于使用的檢測(cè)器和色譜條件不同，分別檢測(cè)，對(duì)實(shí)際操作造成麻煩。氯仿 用HP -5毛細(xì)管色譜柱，F(xiàn)ID檢測(cè)器，進(jìn)樣口溫度200℃，檢測(cè)器溫度300℃；程序升溫：35℃保持8分鐘，以每分鐘100℃的升溫速度升溫至230℃，保持8分鐘?！《燃淄?采用固定液為二甲基聚烷氧烷的石英毛細(xì)管柱，電子捕獲檢測(cè)器，程序升溫，在45℃保持5分鐘，再以每分鐘10℃的速率升至180℃，保持3分鐘，檢測(cè)器溫度250℃，進(jìn)

53、樣口溫度200℃。,新方法的基本思路：由于FID檢測(cè)器對(duì)鹵素的靈敏度較差，對(duì)氯仿實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中色譜圖峰型較差，常常拖尾，且二氯甲烷檢測(cè)需要換條件檢測(cè)，檢測(cè)過(guò)程較繁瑣。采用ECD檢測(cè)器，有較好的靈敏度，可以保證很好的峰型，因此，基于上述缺點(diǎn)，本方法改進(jìn)的目的是配制氯仿和二氯甲烷混合的對(duì)照品溶液和供試品溶液，放頂空瓶進(jìn)樣，以外標(biāo)法計(jì)算。選擇合適的色譜條件一次進(jìn)樣將氯仿和二氯甲烷分開(kāi)，分離度大于1.5，節(jié)約時(shí)間，節(jié)省溶劑。,方法學(xué)驗(yàn)證檢驗(yàn)項(xiàng)目

54、（參考2019版藥典附錄194藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則）：準(zhǔn)確度、精密度、專(zhuān)屬性、檢測(cè)限、定量限、線性、范圍、耐用性等雜質(zhì)測(cè)定項(xiàng)要求。,頂空進(jìn)樣法,頂空進(jìn)樣法為頂空裝置與氣相色譜儀聯(lián)用的儀器。它利用被測(cè)樣品（氣-液和氣-固）加熱平衡后，取其揮發(fā)氣體部分進(jìn)入氣相色譜儀。它專(zhuān)用于分析易揮發(fā)的微量成分，如對(duì)甲醇、乙醇等易揮發(fā)的殘留溶劑類(lèi)，帶有易揮發(fā)成分的中草藥類(lèi)等均可用它進(jìn)行定量分析。 頂空進(jìn)樣分為溶液頂空和固體頂空。靜態(tài)頂空、動(dòng)