細(xì)胞因子藥物分析

1、十五、生物技術(shù)藥物分析,1、概念：2、分類 ｛,生物技術(shù)藥物,重組DNA藥物重組蛋白質(zhì)藥物,采用DNA重組技術(shù)或其他新生物技術(shù)生產(chǎn)的治療和預(yù)防藥物。,,1、重組蛋白質(zhì)或重組多肽藥物包括： 細(xì)胞因子類：rIFN、IL-2、EPO等； 抗細(xì)胞素治療：CD4可溶性受體等； 重組溶血栓類：rSK、rSAK等； 人源化單克隆抗體制劑； 重組疫苗和菌苗制劑。,2、重組DNA藥物包括：寡核苷酸藥物：反義核酸等；

2、基因藥物：腺病毒-IL-2、腺相關(guān)病毒-凝血Ⅸ因子；腺病毒- P53細(xì)胞治療制劑：抗原致敏的人樹(shù)突狀細(xì)胞 DNA疫苗：治療乙型肝炎、愛(ài)滋病的核酸疫苗等。,生物技術(shù)藥物的質(zhì)量控制與傳統(tǒng)生產(chǎn)方法所得產(chǎn)品有本質(zhì)的差別?？赡軙?huì)含有用傳統(tǒng)生產(chǎn)方法不可能存在的有害雜質(zhì)。例如在細(xì)菌中表達(dá)的產(chǎn)品可能有內(nèi)毒素、致敏原，在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的產(chǎn)品可能有DNA雜質(zhì)和病毒。,重組產(chǎn)品質(zhì)量控制上存在的難點(diǎn),建立重組藥物的生物學(xué)活性測(cè)定方法；理化測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定

3、性；人源化單抗中的人源化程度檢測(cè)方法及標(biāo)準(zhǔn)研究；重組人白蛋白等大劑量重組產(chǎn)品安全性評(píng)價(jià)問(wèn)題；反義核酸藥物理化特性測(cè)定和效力測(cè)定，即如何評(píng)價(jià)反義核酸的體內(nèi)及體外活力；基因治療藥物的安全性評(píng)價(jià)包括反轉(zhuǎn)錄病毒、生物分布和效力測(cè)定；DNA疫苗的安全性和效力檢測(cè)方法研究；干細(xì)胞治療產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立（干細(xì)胞鑒定及活力測(cè)定） 。,生物技術(shù)藥物的質(zhì)量控制,生物技術(shù)藥物的特點(diǎn)：1、來(lái)源：活的生物體（細(xì)菌或細(xì)胞）；2、結(jié)構(gòu)：復(fù)雜（包括組

4、成、空間結(jié)構(gòu)）；3、生產(chǎn)：涉及生物材料和生物學(xué)過(guò)程（發(fā) 酵、細(xì)胞培養(yǎng)，分離純化等）， 有其固有的易變性。,生物技術(shù)藥物的質(zhì)量控制,質(zhì)量控制包括兩個(gè)方面：1、生產(chǎn)過(guò)程中質(zhì)量控制GMP（硬件、軟件）2、最終目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制（方法學(xué)研究）,質(zhì)量控制方法學(xué)研究具體內(nèi)容,一、結(jié)構(gòu)鑒定和確證二、生物學(xué)活性測(cè)定和比活性三、蛋白質(zhì)純度檢查四、蛋白質(zhì)含量測(cè)定五、蛋白質(zhì)藥物理

5、化性質(zhì)的鑒定六、殘余雜質(zhì)檢查,一、鑒定,采用適宜的技術(shù)鑒定生物技術(shù)原料藥或制劑的物理化學(xué)性質(zhì)、生物活性、免疫化學(xué)性質(zhì)、純度和雜質(zhì)。,1、氨基酸序列,預(yù)期產(chǎn)品的氨基酸序列測(cè)定在很大程度上可應(yīng)用如(b)~(e)款項(xiàng)中提到的測(cè)定方法，隨后與預(yù)期產(chǎn)品基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行比較。,2、氨基酸組成,氨基酸組成是先用各種水解及微量氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定，然后再與產(chǎn)品基因推導(dǎo)的氨基酸組成進(jìn)行對(duì)比。在大部分情況下，氨基酸組成分析對(duì)多肽和小分子蛋白質(zhì)可

6、提供某些有用的結(jié)構(gòu)資料，但對(duì)大分子蛋白很難確定。在大多數(shù)情況下，氨基酸定量分析也可用于確定蛋白質(zhì)含量。,3、N末端和C末端氨基酸測(cè)序,末端氨基酸序列分析是用以鑒別多肽或蛋白質(zhì)的氨基端和羧基端的性質(zhì)及均一性。作為重組蛋白質(zhì)和肽的重要鑒別指標(biāo)，一般要求至少測(cè)定N-末端15個(gè)氨基酸、C-末端1～3氨基酸。如發(fā)現(xiàn)預(yù)期產(chǎn)品的氨基酸末端是異質(zhì)的，應(yīng)用適宜分析方法測(cè)定變異體的相對(duì)含量。,4、肽圖,用酶或化學(xué)物選擇性地將產(chǎn)品切成片段，切成的片段用

7、HPLC、SDS-PAGE電泳法、質(zhì)譜法測(cè)定。驗(yàn)證的方法測(cè)得的原料藥或制劑的肽圖，可作為批檢驗(yàn)中確證預(yù)期產(chǎn)品結(jié)構(gòu)的方法。,5、巰基和二硫鍵,二硫鍵和巰基與蛋白質(zhì)的生物活性密切相關(guān)，發(fā)生錯(cuò)誤配對(duì)，不但活性降低而且會(huì)引起抗原性增加。根據(jù)預(yù)期產(chǎn)品基因序列推導(dǎo)出半骯氨酸殘基，采用肽圖制備(還原和不還原情況下)、質(zhì)譜或其他適宜的技術(shù)，測(cè)定游離SH基和/或二硫鍵的數(shù)目和位置。,評(píng)價(jià)用生物技術(shù)方法生產(chǎn)的糖蛋白時(shí)，應(yīng)考慮糖基化位點(diǎn)的上調(diào)或下調(diào)及其對(duì)

8、生物活性、代謝、穩(wěn)定性、溶解性的影響。每一種真核細(xì)胞具有其獨(dú)特的糖基化能力稱為它的糖類型，通過(guò)基因工程方法將一種糖蛋白在不同細(xì)胞中表達(dá)，可以導(dǎo)致生產(chǎn)不同類型的糖蛋白，即使在相同的細(xì)胞類型中，也可能會(huì)出現(xiàn)糖形成時(shí)由于一些寡糖的精細(xì)結(jié)構(gòu)不同等而產(chǎn)生截然不同的糖蛋白。,6、糖結(jié)構(gòu),對(duì)于糖蛋白，要測(cè)定糖含量(中性糖、氨基糖、唾液酸)。另外，應(yīng)盡可能分析多肽鏈的糖鏈結(jié)構(gòu)、寡糖類型(觸角形狀)和糖基化位點(diǎn)。,二、生物學(xué)活性測(cè)定和比活性,1、意義

9、：1）生物技術(shù)產(chǎn)品的化學(xué)本質(zhì)為蛋白質(zhì)、多肽，其活性由產(chǎn)品的氨基酸序列或其空間結(jié)構(gòu)所形成的活性中心所決定的，與其絕對(duì)質(zhì)量不一致。2）生物技術(shù)產(chǎn)品的生物學(xué)活性與藥效學(xué)基本相一致。3）利用生物學(xué)活性建立的測(cè)定效價(jià)體系，是給藥品定量的依據(jù)，保證產(chǎn)品藥效的重要手段。,有效的效價(jià)測(cè)定是生物技術(shù)原料藥和/或制劑規(guī)范的組成部分。當(dāng)原料藥采用一種效價(jià)測(cè)定方法時(shí)，其制劑可用另一種方法(物理化學(xué)的和/或生物學(xué)的)測(cè)定。但應(yīng)提供選擇方法的依據(jù)。,效價(jià)測(cè)定

10、一般原則:1、國(guó)際通用方法；2、測(cè)定結(jié)果須用國(guó)際或國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品校正，以國(guó)際單位表示。,生物學(xué)活性測(cè)定方法分類,1）體外細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定法　 a、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)作用（G-CSF:NFS-60）　 b、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)作用 (TNF:L929)　 c、間接保護(hù)細(xì)胞作用 (IFN:VISH;VSV)2）離體動(dòng)物器官測(cè)定法 采用家兔主動(dòng)脈條測(cè)定重組腦利鈉肽生物活性。3）體內(nèi)測(cè)定法4）生化酶促反應(yīng)測(cè)定法5）免疫學(xué)活性測(cè)定法,利用動(dòng)物

11、體內(nèi)某些指標(biāo)變化，定出產(chǎn)品的單位，如EPO活性測(cè)定，體內(nèi)注射EPO后，計(jì)算小鼠網(wǎng)織紅細(xì)胞增加的數(shù)量與標(biāo)準(zhǔn)品比較，確定其活性單位。,基于產(chǎn)品與某種物質(zhì)的結(jié)合或產(chǎn)品本身的化學(xué)反應(yīng)為原理設(shè)計(jì)，具有簡(jiǎn)便、精確、穩(wěn)定等特點(diǎn)，如重組鏈激酶、葡激酶生物活性測(cè)定，鏈激酶、葡激酶和纖溶酶原（h-plg）結(jié)合形成復(fù)合物激活游離h-plg原為有活性的纖溶酶。,利用制品免疫原性，制備相應(yīng)單克隆抗體或多克隆抗體，采取 ELISA 法測(cè)定其含量。,生物學(xué)活性測(cè)定方

12、法選擇,體內(nèi)測(cè)定和體外測(cè)定方法: a、體內(nèi)測(cè)定：即整體動(dòng)物測(cè)定，能為較大范圍的重組產(chǎn)品的效價(jià)提供有用信息，但費(fèi)時(shí)、昂貴、難操作及同時(shí)存在倫理問(wèn)題，大多數(shù)情況下傾向于選擇體外測(cè)定方法。 b、體外測(cè)定：可使用分離的器官或組織、原代細(xì)胞或傳代細(xì)胞系，目前最常用方法是連續(xù)生長(zhǎng)、因子依賴的、克隆化的細(xì)胞系的方法，其測(cè)定結(jié)果比較準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、經(jīng)濟(jì)、容易使用和便于統(tǒng)計(jì)分析。,生物學(xué)活性測(cè)定方法選擇,2、定量、半定量、定性方法 a、通過(guò)研

13、究首先選擇能夠定量評(píng)價(jià)的方法，最好的選擇是背景較低的反應(yīng)，并且對(duì)相關(guān)產(chǎn)品有陡峭的、可重復(fù)的劑量-反應(yīng)曲線；其次考慮半定量方法（如NGF），最后考慮定性（如BMP）方法。 b、對(duì)生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，生物學(xué)活性測(cè)定方法復(fù)雜，可采用其他替代方法（如重組人生長(zhǎng)激素用HPLC定量方法代替復(fù)雜生物活性測(cè)定方法）。,細(xì)胞培養(yǎng)法中細(xì)胞染色標(biāo)記方法,3H-thymidine、BrdU 是反映DNA合成、增殖細(xì)胞數(shù)的比例的。BrdU：首先用BrdU做標(biāo)記，

14、固定細(xì)胞，用核苷酸酶處理后使過(guò)氧化物酶結(jié)合抗BrdU抗體發(fā)生反應(yīng)。 MTT（四氮唑鹽）：其在活細(xì)胞的線粒體中可以定量地被琥珀酸脫氫酶還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物MTT formazan,二甲基亞砜（DMSO）和酸化的異丙醇或酸化的SDS均能溶解紫色結(jié)晶物，通過(guò)比色法測(cè)定MTT formazan的量可以反映線粒體電子傳遞系統(tǒng)機(jī)能，間接表示細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。,Alamar Blue：氧化型Alamar Blue（600nm

15、）可被活細(xì)胞中的線粒體酶還原，還原后染料（570nm）發(fā)生顏色和熒光改變，顏色和熒光的深淺與活細(xì)胞數(shù)成正比，可用分光光度計(jì)或熒光檢測(cè)儀檢測(cè)。 Crystal violet：染活細(xì)胞后，在比色計(jì)中測(cè)定光吸收值（A），A值與著染色細(xì)胞數(shù)成正比。,,,幾種細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定方法比較 3H-thymidine BrdU MTT

16、 Alamar Blue靶向物 DNA合成系統(tǒng) 線粒體電子傳遞系統(tǒng)檢出細(xì)胞的狀態(tài) 增殖 增殖、生存檢出法 放射活性 色素、熒光 色素 色素、

17、熒光抽出的必要性 + + + -其他試劑的必要性 + ++ + -成本（以MTT為1時(shí)）60

18、 80-100（試劑盒） 1 2缺點(diǎn) 使用同位素 不適合 檢出大量未增殖 檢出未增 浮游細(xì)胞 細(xì)胞，處理時(shí)費(fèi)力 殖活細(xì)胞,,,,,,,,,,,,生物

19、學(xué)活性測(cè)定分析方法,1、用能誘導(dǎo)50%最大反應(yīng)的待測(cè)樣品最高稀釋度作為參考效價(jià)（或滴度），或以此稀釋度中所含樣品的量為1單位，即以此稀釋度的倒數(shù)為待測(cè)樣品所含的單位數(shù)。 2、比較已知濃度或活性單位樣品標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。,,,,,,,,活性標(biāo)準(zhǔn)品,待測(cè)樣品,稀釋度,a b,A值,生物學(xué)測(cè)定基本模式圖,蛋白質(zhì)藥物的比活性測(cè)定的意義,1、比活性：每毫克蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性單位。2、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)不能常規(guī)測(cè)定，而它的改變（如

20、二硫鍵的錯(cuò)誤配對(duì)）可影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性，從而影響藥效，比活性可以反映此種情況。3、比活性可反映產(chǎn)品生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定情況，可比較不同表達(dá)體系、不同生產(chǎn)廠家生產(chǎn)同一產(chǎn)品時(shí)的質(zhì)量情況。4、比活性是重組蛋白質(zhì)藥物不同于化學(xué)藥的一項(xiàng)重要指標(biāo)，也是進(jìn)行成品分裝的重要定量依據(jù)。,生物活性測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)范圍確定,1、使用驗(yàn)證過(guò)的測(cè)定和分析方法，并提供用此方法的效價(jià)測(cè)定平均值和單測(cè)定一批誤差的可信限范圍。2、對(duì)于成品的生物活性測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，要根據(jù)不同方法的

21、特點(diǎn)規(guī)定相當(dāng)標(biāo)示量的范圍，目前，生物活性的測(cè)定方法有四類：動(dòng)物基礎(chǔ)、細(xì)胞基礎(chǔ)、生化（酶）法、特異（免疫、受體）結(jié)合法。,不同生物活性測(cè)定方法的規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)表 測(cè)定方法 規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物基礎(chǔ)的生物活性測(cè)定 70%～130%標(biāo)示量細(xì)胞基礎(chǔ)的生物活性測(cè)定 80%～120%標(biāo)示量體外酶法的生物活性測(cè)定 85%～115%標(biāo)示量受體結(jié)合的生物活性測(cè)定

22、 85%～115%標(biāo)示量,,,,生物學(xué)活性效價(jià)測(cè)定過(guò)程中標(biāo)準(zhǔn)品的作用,1、生物學(xué)活性測(cè)定變異范圍大，同樣制品在不同實(shí)驗(yàn)室測(cè)定結(jié)果差異很大，必須有一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。2、標(biāo)準(zhǔn)品的使用，最大限度地減少實(shí)驗(yàn)室之間和各種影響測(cè)定因素地干擾。,物理化學(xué)方法取代生物方法的條件,產(chǎn)品的物理化學(xué)方法數(shù)據(jù)較完善，并已證實(shí)其高級(jí)結(jié)構(gòu)。 物理化學(xué)與生物試驗(yàn)之間的關(guān)系亦已闡明。 工廠已積累了足夠數(shù)據(jù)，可用物理方法取代。 當(dāng)產(chǎn)品僅用物理化學(xué)

23、方法表示生物活性，結(jié)果應(yīng)用重量表示。 產(chǎn)品出廠檢定，工廠可合理選擇定量方法（生物測(cè)定還是物理化學(xué)鑒定）,三、蛋白質(zhì)純度檢查,生物技術(shù)原料藥和制劑的絕對(duì)純度難以測(cè)得，并且所得結(jié)果與所用方法有關(guān)。原料藥和制劑的純度一般是用幾種方法合并估計(jì)的。分析方法的選擇和優(yōu)化主要應(yīng)考慮的因素是預(yù)期產(chǎn)品與產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)和產(chǎn)品雜質(zhì)的分離。,由于生物技術(shù)產(chǎn)品及生物制品的分子特征和獨(dú)特的生物合成過(guò)程，產(chǎn)品可含有幾種分子實(shí)體或變異體。如這些分子實(shí)體來(lái)源于所預(yù)

24、期的翻譯后修飾品，則應(yīng)作為預(yù)期產(chǎn)品的一部分。預(yù)期產(chǎn)品在生產(chǎn)和/或儲(chǔ)存過(guò)程中形成的變異體，如其性質(zhì)與預(yù)期產(chǎn)品相似，應(yīng)作為產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)，而不是雜質(zhì)。對(duì)于批檢驗(yàn)，只需選用一部分適用的方法并闡明其純度測(cè)定的合理性。,按WHO規(guī)定必須用HPLC和非還原SDS-PAGE兩種方法測(cè)定，其純度都應(yīng)達(dá)到95%以上，有的甚至要求達(dá)到99%以上。純度的檢查通常是在原液中進(jìn)行。方法：非還原SDS-PAGE電泳法、HPLC法、毛細(xì)管電泳。,（1）非還原S

25、DS-PAGE電泳法： 1）銀染加樣量≥5ug （1～10ng） 2）考馬斯亮藍(lán)R-250 加樣量≥10ug （100ng） 結(jié) 果：無(wú)明顯雜蛋白帶出現(xiàn)；目標(biāo)蛋白量應(yīng)不低于總蛋白量的95%或98%。蛋白質(zhì)樣品在荷質(zhì)比均一。,（2）HPLC法：分子篩、反相層析，離子交換層析，盡量采用與SDS-PAGE原理不同的反相或離子交換層析，不主張用分子篩分析。 （3）毛細(xì)管電泳：簡(jiǎn)便

26、、快速、靈敏度和分辨率高；價(jià)格高、重現(xiàn)性差。,,幾種檢定重組蛋白純度方法的比較特性 HPLC SDS-PAGE、IEF CE分離機(jī)制 極性、非極性分配， 電荷、等電點(diǎn) 電荷等 分子大小、離子交換 分析所需時(shí)間 10～120mi

27、n 幾小時(shí) 10～30min 分辨力 好 好 好樣品體積 10～50ul 1～50ul

28、1～50nl 靈敏度范圍 ng ～ug ng～ug pg 定量準(zhǔn)確性 + ± +分析方式 紫外、熒光、折射 紫外（可見(jiàn)、

29、熒光） 同HPLC 電化學(xué)、放射性 銀染、放射自顯影儀器價(jià)格 中～高 低 中～高日常消耗 低 高

30、 低自動(dòng)化 中～高 低 中～高人力操作 低 高 低制備級(jí)

31、 中 中 微量級(jí)制備收集樣品 可以 可以 較困難,,,,,用于研究蛋白質(zhì)純度的方法和機(jī)制 方法 分析機(jī)

32、制 反相HPLC 疏水性 疏水性相互作用HPLC 疏水性 毛細(xì)管電泳 荷質(zhì)比 離子交換HPLC 電荷 等電聚焦 電荷 聚丙烯酰胺凝膠電泳 電荷比 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 電荷，分子大小 分子排阻HPLC

33、 分子大小 質(zhì)譜測(cè)量法 分子大小,,,,四、蛋白質(zhì)含量測(cè)定,一般采用蛋白質(zhì)的含量測(cè)定。在產(chǎn)品以效價(jià)表示時(shí)，不必另測(cè)含量。有時(shí)還要證明所得量值直接與生物測(cè)定值相關(guān)。如已證實(shí)相關(guān)性，在生產(chǎn)過(guò)程中可測(cè)定含量而不測(cè)定生物活性。,可根據(jù)物理化學(xué)性質(zhì)采用Folin-酚試劑法（Lowry法）、染色法（Bradford法）、雙縮脲法、紫外吸收法、HPLC法和凱氏定氮等方法。,Folin-酚試劑法：

34、磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基還原，產(chǎn)生深藍(lán)色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，藍(lán)色深度與蛋白的量成正相關(guān)。靈敏范圍：5～100ug/ml；優(yōu) 點(diǎn)：簡(jiǎn)便、靈敏度較高；不同蛋白質(zhì)間的變異少；缺 點(diǎn)：受多種物質(zhì)干擾，反應(yīng)速度慢，某些試劑不穩(wěn)定。,Bradford法是采用考馬斯亮藍(lán)-G250與蛋白質(zhì)結(jié)合的原理，迅速、靈敏的定量測(cè)定蛋白質(zhì)的方法；靈敏范圍：25～200ug/ul，需要時(shí)間：10min。,紫外

35、吸收法:蛋白質(zhì)分子中常含有酪氨酸(275nm)、色氨酸(280nm)、苯丙氨酸(257nm)等苯環(huán)結(jié)構(gòu)，在紫外280nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，其光吸收值與蛋白質(zhì)濃度成正比，故可以用280nm波長(zhǎng)吸收值大小來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。靈敏范圍：0.2～2mg/ml簡(jiǎn)單、省時(shí)受光吸收物質(zhì)影響蛋白濃度（mg/ml）﹦1.55A280-0.76A260,,蛋白質(zhì)常用的定量方法的比較方法 所需蛋白質(zhì) 破壞 蛋白質(zhì)/蛋白 技

36、術(shù) 方法的變異 的量（mg/ml） 與否 質(zhì)變化情況 復(fù)雜性 系數(shù)（%）雙縮脲 0.5～5 是 少 簡(jiǎn)單、快速 5Lowry 0.05～5 是 中等 顯色慢、試劑多 5凱氏定氮 0.05～3 是 少 干擾、復(fù)雜、慢 0.154紫外吸收法

37、 0.05～2 否 大 簡(jiǎn)單、快速、 0.439（280nm） 干擾物質(zhì)多染料結(jié)合法 0.01～0.05 是 中等 簡(jiǎn)單、快速 3.75熒光法 0.001～0.01 否 中等 較易 3.75,,,,五、蛋白質(zhì)藥物理化性質(zhì)的鑒定,分子量及分

38、子大小異構(gòu)體消光系數(shù)(克分子吸收系數(shù))電泳圖譜液相色譜圖光譜圖等電點(diǎn)測(cè)定,1、分子量及分子大小測(cè)定,還原型SDS-PAGE：蛋白質(zhì)在SDS和β-巰基乙醇存在下沸水浴5min，形成表面帶大量負(fù)電荷的桿狀分子，降低了分子形態(tài)和電荷的影響，在電泳過(guò)程中蛋白遷移率基本只與其相對(duì)分子質(zhì)量相關(guān)。凝膠過(guò)濾（分子篩）法：根據(jù)蛋白分子大小和性狀進(jìn)行測(cè)定。質(zhì)譜法：根據(jù)荷質(zhì)比進(jìn)測(cè)定。,2、異構(gòu)體,用等電聚焦或其他適宜的技術(shù)（反相色譜）測(cè)定。,

39、3、消光系數(shù)(克分子吸收系數(shù)),一般應(yīng)在特定的紫外/可見(jiàn)光波長(zhǎng)(如280nm)條件下測(cè)定預(yù)期產(chǎn)品的消光系數(shù)。消光系數(shù)是用已知蛋白質(zhì)量(用氨基酸組分分析或定氮法測(cè)得)的產(chǎn)品溶液，用紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定。如產(chǎn)品用紫外/可見(jiàn)分光光度測(cè)定其蛋白質(zhì)含量，則必須采用消光系數(shù)法。,4、電泳圖譜,產(chǎn)品的電泳圖及其鑒別，可用聚丙烯胺凝膠電泳、等電聚焦、SDS—聚丙烯胺凝膠電泳、Western Blot、毛細(xì)管電泳或其他適宜的方法測(cè)得。,5、液相色譜

40、圖,產(chǎn)品的色譜圖及產(chǎn)品的鑒別、同質(zhì)性和純度的資料，可用分子排阻色譜、反向液相色譜、離子交換液相色譜、親和層析或其他適宜的技術(shù)方法測(cè)定。,6、光譜圖,可測(cè)定產(chǎn)品的紫外吸收光譜。對(duì)某一重組蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，其最大吸收波長(zhǎng)是固定的。在生產(chǎn)工程中每批產(chǎn)品的紫外吸收光譜應(yīng)當(dāng)一致。重組產(chǎn)品一級(jí)結(jié)構(gòu)不含芳香族氨基酸，可不做紫外吸收光譜測(cè)定。,對(duì)于產(chǎn)品的高級(jí)結(jié)構(gòu)需用圓二色性、磁共振和其他適宜的技術(shù)測(cè)定。,7、等電點(diǎn)測(cè)定,重組蛋白質(zhì)藥物的等電點(diǎn)往往是不均

41、一的，但在生產(chǎn)過(guò)程中批與批之間的電泳結(jié)果應(yīng)一致，以說(shuō)明其生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性。方法：等電聚焦電泳法(IEF) 毛細(xì)管電泳法。,六、免疫化學(xué)性質(zhì),當(dāng)產(chǎn)品是抗體時(shí)，對(duì)其免疫性質(zhì)應(yīng)全面鑒定。用抗體與純化抗原和抗原特定區(qū)結(jié)合試驗(yàn)來(lái)確定親和力、親和性和免疫反應(yīng)性(包括交叉反應(yīng)性)。如條件許可，應(yīng)用生化方法確定抗原表位和帶有相關(guān)抗原表位的靶分子。對(duì)于有些原料藥和制劑，需用抗體識(shí)別蛋白分子不同表位的免疫化學(xué)方法(如ELISA，We

42、stern Blot)檢測(cè)蛋白分子蛋白質(zhì)的免疫化學(xué)性質(zhì)可用于鑒別、均一性或純度測(cè)定，也可用于定量。,工藝相關(guān)雜質(zhì)是指生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的雜質(zhì)，如細(xì)胞基質(zhì)(宿主細(xì)胞蛋白、宿主細(xì)胞DNA)、細(xì)胞培養(yǎng)物(誘導(dǎo)劑、抗生素或培養(yǎng)基成分)或下游工序產(chǎn)生的雜質(zhì)。,七、殘余雜質(zhì)檢測(cè),1、對(duì)殘余雜質(zhì)進(jìn)行限制的意義 a、殘余雜質(zhì)可能具有毒性，引起安全性問(wèn)題； b、可能影響產(chǎn)品的生物學(xué)活性和藥理作用，或使產(chǎn)品變質(zhì)； c、反映產(chǎn)品生產(chǎn)工藝的

43、穩(wěn)定性。,2、生產(chǎn)工藝相關(guān)雜質(zhì)和污染物,宿主細(xì)胞蛋白含量宿主細(xì)胞DNAIgG含量（10ng/劑量）蛋白A含量小牛血清殘留量殘余抗生素（氨芐西林）內(nèi)毒素含量（LAL）污染物,（1）宿主細(xì)胞蛋白含量,以雙抗體夾心ELISA為宜，盡量不用斑點(diǎn)免疫。常采用5種最常用的E.coli菌株混和作為ELISA測(cè)菌體蛋白含量的通用標(biāo)準(zhǔn)。不同表達(dá)體系對(duì)菌體蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)不同。 來(lái)自E.coli菌株的產(chǎn)品為不大于0.1%；來(lái)自CHO細(xì)胞的

44、產(chǎn)品為不大于0.05%。,（2）宿主細(xì)胞DNA,測(cè)定方法：采用DNA雜交實(shí)驗(yàn)，用固相斑點(diǎn)雜交法，以地高辛標(biāo)記檢測(cè)試劑盒或者用同位素標(biāo)記DNA探針進(jìn)行測(cè)定，必須提供相應(yīng)宿主細(xì)胞DNA標(biāo)準(zhǔn)品。現(xiàn)行生物制品規(guī)程對(duì)宿主細(xì)胞DNA殘留量標(biāo)準(zhǔn)作了相應(yīng)調(diào)整： 由小于100pg/劑量調(diào)整為小于10ng/劑量。宿主細(xì)胞DNA只作為一種細(xì)

45、胞污染因素不作為一種危險(xiǎn)因素。,,（3）污染物,產(chǎn)品污染物是指帶入的外源性物質(zhì)而不是生產(chǎn)工藝的一部分，如化學(xué)及生化物質(zhì)(微生物蛋白酶)和/或微生物。應(yīng)嚴(yán)格避免污染物，并用合適的認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)或內(nèi)控限值來(lái)控制其限度。外源性病毒和支原體污染。,產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)(如前體、某些降解產(chǎn)物)是在生產(chǎn)和/或貯存過(guò)程中產(chǎn)生的分子變異體，這些變異體在活性、有效性及安全性方面與預(yù)期產(chǎn)品相比，不占主導(dǎo)地位。,3、產(chǎn)品有關(guān)雜質(zhì),截短式（Truncated forms

46、），蛋白質(zhì)/多肽中失去氨基酸或內(nèi)部裂解。 去酰胺化，異構(gòu)化，S－S鏈誤聯(lián)，氧化形式等。 聚合類雜質(zhì)，包括雙聚體、多聚體。,八、安全性及其他檢測(cè)項(xiàng)目,無(wú)菌試驗(yàn)熱源試驗(yàn)異常毒性試驗(yàn)免疫原性檢查水分、裝量、pH檢測(cè),幾種生物技術(shù)藥物檢驗(yàn)項(xiàng)目表,幾種生物技術(shù)藥物檢驗(yàn)項(xiàng)目表,幾種生物技術(shù)藥物檢驗(yàn)項(xiàng)目表,幾種生物技術(shù)藥物檢驗(yàn)項(xiàng)目表,由免疫細(xì)胞及非免疫細(xì)胞 經(jīng)刺激而合成、分泌的一類具有多 種生物活性的小分子蛋白質(zhì),第二節(jié)、細(xì)胞因子

47、（Cytokine）,已批準(zhǔn)上市的細(xì)胞因子生物技術(shù)藥物,細(xì)胞因子的來(lái)源,活化的免疫細(xì)胞：淋巴細(xì)胞尤其是T細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等?；|(zhì)細(xì)胞類：血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細(xì)胞等。某些腫瘤細(xì)胞。,二、細(xì)胞因子的共同特性,（一）結(jié)構(gòu)特點(diǎn):*屬低分子量（6-60kD）的多肽或糖蛋白*分型：分泌型和跨膜型（TNF；TGF-α；SCF）*存在形式：?jiǎn)误w(IL-1,2等)；二聚體（IL-5，

48、12）；三聚體（TNF)。,功能：與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、造血功能和炎癥反應(yīng)有關(guān)。作用方式:自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌；,76,CKs的共同特性及作用特點(diǎn)：1）高效性： 靶細(xì)胞-受體；高親和力結(jié)合2）分泌性： 旁分泌、自分泌、內(nèi)分泌；短時(shí)自限3）多效性： 一CK多靶多效4）重疊性： 多CK一靶一效5）協(xié)同性： 一CK強(qiáng)化它CK6）拮抗性： 一CK抑制它CK7）網(wǎng)絡(luò)性： 多CK互相平衡8）同源性和多源性,多效性,重疊性,協(xié)同,拮抗,

49、Cascade induction,網(wǎng)絡(luò)性,NK1+T,,,,,,,,,,IL- 4,,骨髓基質(zhì)細(xì)胞,IL-1 IL-6 IL-7 SCF,,造血干細(xì)胞,IL-1 IL-6 IL-11 TNF-a GM-CSF G-CMF M-CSF,單核細(xì)胞,中性粒細(xì)胞,嗜酸性粒細(xì)胞,,IL-1 IL-8 TNF-a,IL-1 TNF-a,,,IL-10 IL- 4,,IL- 4 IL-6,,IL-10 IL-13 IL-4 TGF-b

50、,,,IL-4 IL-5 IL-6 IL-13 IL-10 TGF-b,,IL-4,IL-4,內(nèi)皮細(xì)胞,,IL-4,,IL-4,,IL-2 IFN-g,,IL-10 IL-13 IL-4,NK 細(xì)胞,,IFN-g,,IL-2,,IL-2 IFN-g,,IL-2,,IL-2 IL-12,,G-CMF IFN-g GM-CSF,IL-12,,,IL-1 TNF-a TGF-b PDGF FGF,M-CSF GM-CSF,,

51、內(nèi)皮細(xì)胞,纖維母細(xì)胞,下 丘 腦,,IL-1 TNF-a,M-CSF GM-CSF,,,IL-1 IL-6 TNF-a,,,IL- 4,IL- 6,IL- 4,三 細(xì)胞因子的功能分類,干擾素(Interferon, IFN)白細(xì)胞介素(interleukin, IL)集落刺激因子(colony stimulating factor,CSF)腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor,TNF)生長(zhǎng)因子(Gro

52、wth factor, GF)趨化因子(chemokine CK),一、干擾素（interferon; IFN）,干擾素是由病毒和其他種類的干擾素誘導(dǎo)劑，通過(guò)刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（人體免疫系統(tǒng)的一種）、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及體細(xì)胞所產(chǎn)生的一種糖蛋白。這種蛋白具有多種生物活性，包括抗增殖、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒和誘導(dǎo)分化作用。 根據(jù)分子結(jié)構(gòu)和抗原性的差異分為α、β、γ、ω等4個(gè)類型。,現(xiàn)狀,目前可供臨床選用的干擾素種類很多。例如國(guó)產(chǎn)重組 IFN

53、－α1型和IFN－α2型，進(jìn)口的干擾能（IFN－α2b）、干擾素（ IFN－α2a）、惠福仁（類淋巴母細(xì)胞干擾素）及組合干擾素等等。,干擾素生產(chǎn)工藝路線（1）,體外誘生干擾素制備工藝： Sendai病毒誘導(dǎo)人白細(xì)胞1989年：IFNα-n3/Alferon，批準(zhǔn)上市產(chǎn)量低：1g IFNα，需要 3億ml人血白細(xì)胞來(lái)源困難，工藝復(fù)雜，收率低，價(jià)格昂貴潛在的血源性病毒污染的可能性,干擾素生產(chǎn)工藝路線（2）,人源轉(zhuǎn)化細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工

54、藝： 1999年：IFN α-n1/Wellferon, 批準(zhǔn)用于臨床。 優(yōu)點(diǎn)：首次實(shí)現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。 缺點(diǎn)： 活性低，退出臨床應(yīng)用。,干擾素生產(chǎn)工藝路線（3）,上市產(chǎn)品：重組人干擾素rhuIFN 1986，rhuIFNα-2a， rhuIFNα-2b； 1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b； 2001－2002： PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasys 表達(dá)產(chǎn)物：無(wú)糖基化，N

55、-met，無(wú)活性包涵體工藝特點(diǎn)：發(fā)酵過(guò)程，隨后變性、復(fù)性過(guò)程。,基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝:,干擾素生產(chǎn)工藝路線（4）,上市產(chǎn)品：rhuIFN β-1a1996， Avonex(Biogen)； 2002， Rebif(Serono)表達(dá)產(chǎn)物：166 aa 糖基化蛋白，22.5 ku工藝特點(diǎn)：分泌表達(dá)，產(chǎn)量低，成本高,過(guò)程嚴(yán)格,動(dòng)物無(wú)限細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：,干擾素生產(chǎn)工藝路線（5）,?宿主：腐生型假單胞桿菌（Pseudom

56、onas putida）?上市產(chǎn)品：IFN α-2b/安福隆?表達(dá)產(chǎn)物：無(wú)糖基化可溶性蛋白質(zhì)，具有天然分子結(jié)構(gòu)和生物活性?工藝特點(diǎn)：發(fā)酵周期短：幾個(gè)小時(shí)無(wú)需變性、復(fù)性過(guò)程，獲得有活性產(chǎn)品純化過(guò)程：淘汰抗體親和層析,基因工程假單胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝:,半成品檢定,（1）效價(jià)測(cè)定 用細(xì)胞病變抑制法，以Wish細(xì)胞、VSV病毒為基本檢測(cè)系統(tǒng)，測(cè)定中必須用國(guó)家或國(guó)際參考品校準(zhǔn)為國(guó)際單位。（2）蛋白質(zhì)含量測(cè)定 福林

57、-酚法，以中國(guó)藥品生物制品檢定所提供的標(biāo)準(zhǔn)蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。（3）比活性 效價(jià)的國(guó)際單位與蛋白質(zhì)含量的毫克數(shù)之比。（4）純度 電泳純度用非還原型SDS-PAGE法，銀染顯色應(yīng)為單一區(qū)帶，經(jīng)掃描儀測(cè)定純度應(yīng)在95%以上。,（5）相對(duì)分子量測(cè)定 還原型SDS-PAGE，加樣量不地域微克，同時(shí)用已知相對(duì)分子量的蛋白標(biāo)準(zhǔn)系列做對(duì)照，以遷移率為橫坐標(biāo)，相對(duì)分子量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，計(jì)算相對(duì)分子量。與理論值比較，誤差不

58、得高于10%。（6）殘余外源性DNA含量測(cè)定 用放射性核素或生物素探針?lè)y(cè)定，每劑量中殘余外源性DNA應(yīng)低于100pg。（7）殘余血清IgG含量測(cè)定 在應(yīng)用抗體親和層析法作為純化方法時(shí)必須進(jìn)行此項(xiàng)檢定。（8）殘余抗生素活性測(cè)定 半成品中不應(yīng)有抗生素活性存在。,（9）紫外光譜掃描 檢查半成品的光譜吸收值，最大吸收值應(yīng)在280±2納米。（10）肽圖測(cè)定 用CNBr裂

59、解法，測(cè)定結(jié)果應(yīng)符合干擾素的結(jié)構(gòu)，且批與批之間應(yīng)一致。（11）等電點(diǎn)測(cè)定 等電聚焦電泳。（12）除菌半成品應(yīng)做干擾素效價(jià)測(cè)定、無(wú)菌試驗(yàn)和熱源質(zhì)試驗(yàn)。,成品檢定,（1）物理性狀 凍干品白色或微黃色疏松體，加入注射水后不得含有肉眼可見(jiàn)不溶物。（2）鑒別試驗(yàn) 應(yīng)用ELISA或中和試驗(yàn)檢定。（3）水分測(cè)定 用卡氏法，應(yīng)低于3%。（4）無(wú)菌試驗(yàn) 同半成品。,（5）熱原質(zhì)試