病毒的純化和檢測改

1、第一節(jié) 病毒的純化,一、病毒純化前的準備工作,繁殖病毒,利用生物學(xué)方法純化病毒,病毒感染的純化與診斷,二、標本的采取與送檢,應(yīng)注意下列原則：1.對本身帶有雜菌 (如咽拭子、糞便) 或易受污染的標本，要進行病毒分離培養(yǎng)時，應(yīng)使用抗生素。 2.因病毒在室溫中易失去活性，標本應(yīng)低溫保存并盡快送檢。 3.血清學(xué)診斷標本的采取應(yīng)在發(fā)病初期和病后各取血清，以便對比雙份血清抗體效價的動態(tài)變化。,三、病毒和病毒成份的提純,病毒純度的判定依據(jù)：,

2、物理均一性； 病毒滴度與蛋白含量的比例； 免疫反應(yīng)單一而無非特異反應(yīng)；結(jié)晶形成,在病毒不失活的前提下，從宿主細胞中釋放出來；病毒的純化可以應(yīng)用提純蛋白質(zhì)的技術(shù)方法；對大小、形狀和密度高度一致的病毒粒子， 可以采用分級分離的技術(shù)。,病毒提純的主要原則：,四、病毒萃取液的分級純化,沉淀法,中性鹽沉淀法,聚乙二醇沉淀法,有機溶劑沉淀法,等電點沉淀法,離 心 法,差速離心法,密度梯度離心法,速率區(qū)帶離心法,等密度區(qū)帶法,凝膠色譜

3、法,電泳法,病毒的感染單位（IU）：能夠引起宿主或宿主細胞發(fā)生一定特異性反應(yīng)的病毒最小劑量；病毒效價：指單位體積(ml)病毒懸液的感染單位數(shù)目(IU／ml)或稱毒力 ；噬菌體效價（pfu) ：又稱噬菌斑形成單位數(shù)指單位體積的噬菌體，能使感染細菌裂解，產(chǎn)生噬菌斑的數(shù)量。,因為病毒粒子對細菌細胞感染率不會超過100％，所以根據(jù)噬菌斑或空斑計算出的病毒粒子數(shù)總比噬菌體電鏡下觀察數(shù)低。,一、侵染力的測定,第二節(jié) 病毒的檢測,,半致死劑量

4、(LD50) ： 使半數(shù)宿主細胞死亡的病毒劑量稱半致死劑量；半致感染劑量(ID50) ：使半數(shù)宿主細胞發(fā)生感染的病毒劑量 ；半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50) ：使半數(shù)組織培養(yǎng)物發(fā)生感染，產(chǎn)生細胞病變效應(yīng)的病毒劑量。,二、病毒的培養(yǎng),1.動物接種 是最原始的病毒培養(yǎng)方法，根據(jù)病毒種類不同，選擇敏感動物及適宜接種部位，如嗜神經(jīng)性病毒（狂犬病毒）可接種于小鼠腦內(nèi)，痘病毒可接種于家兔角膜或皮內(nèi)。,2.雞胚培養(yǎng) 雞胚對多種

5、病毒敏感。一般采用孵化9～14天的雞胚，根據(jù)病毒種類不同，將病毒標本接種于雞胚的不同部位，最常用的雞胚接種部位有：羊膜腔、尿囊腔、絨毛尿囊膜和卵黃囊等。,3.組織培養(yǎng)法 (tissueculture) 或細胞培養(yǎng) (cellculture)法 是將離體活組織塊或分散的組織細胞加以培養(yǎng)的技術(shù)總稱，為病毒分離鑒定中的最常用的基本方法。,細胞的變化有些病毒在細胞內(nèi)增殖時可引起特有的細胞病變，稱為細胞病變效應(yīng) (CPE)。常見的變化有

6、細胞變圓、聚集、壞死、溶解或脫落等。有些病毒如麻疹病毒、CMV、RSV等 作用于細胞膜，可使鄰近的細胞相互融合，形成多核巨細胞或稱融合細胞。 有些病毒 (如狂犬病病毒、麻疹病毒等) 可在培養(yǎng)細胞中形成胞漿或核內(nèi)的包涵體。,病毒在培養(yǎng)細胞中增殖的指標,2.紅細胞吸附 (hemadsorption,HAd)流感或副流感病毒等感染細胞后，由于細胞膜上出現(xiàn)了血凝素(haemagglutinin,HA)，具有吸附脊椎動物 (豚鼠、雞、猴等)

7、 紅細胞的能力，這一現(xiàn)象稱紅細胞吸附，常用來測定具有HA的粘病毒與副粘病毒的增殖。若有相應(yīng)的抗血清，則能中和細胞膜上的HA，HAd不再發(fā)生，稱紅細胞吸附抑制試驗。,3.干擾現(xiàn)象(interference) 某些病毒感染細胞時不出現(xiàn)CPE或其他易于測出的變化(如HAd)，但能干擾在其后感染的另一病毒的增殖。如風(fēng)疹病毒感染Vero細胞時CPE不明顯，但它能干擾后感染的?？刹《?(ECHOV) 的增殖，從而阻抑后者所特有的CPE。,4.

8、細胞代謝的改變 病毒感染細胞的結(jié)果可使培養(yǎng)液的pH值改變，說明細胞的代謝在病毒感染后發(fā)生了變化。這種培養(yǎng)環(huán)境的生化改變也可作為判斷病毒增殖的指標。,(二) 病毒的數(shù)量與感染性測定,1.蝕斑測定 是一種檢查和準確滴定病毒感染性的方法。將稀釋的病毒懸液加入單層細胞培養(yǎng)瓶中。病毒吸附后，再覆蓋一層融化的半固體營養(yǎng)瓊脂，使病毒在單層細胞培養(yǎng)中有限擴散。結(jié)果是每一個有感染性的病毒在單層細胞中可產(chǎn)生一個局限性的感染灶。用活性染料

9、(如中性紅) 染色，則活細胞著色，受病毒感染而破壞的細胞不著色，形成肉眼可見的蝕斑(plaque)。每個蝕斑是由一個感染性病毒顆粒形成的，稱作蝕斑形成單位 (plaque forming unit,PFU)。病毒懸液中的感染性病毒量的滴度可用PFU／ml表示。,2.50%組織細胞感染量 (TCID50)測定法 該方法是測定病毒能使50%的組織培養(yǎng)細胞發(fā)生感染的最小量。一般是將病毒懸液作10倍的系列稀釋，分別接種細胞，經(jīng)一定時間

10、后觀察CPE、血細胞吸附等指標，以最高稀釋度能感染50%細胞的量為終點。最后用統(tǒng)計方法計算出50%組織細胞感染量。,三、病毒感染的血清學(xué)診斷,原理是用已知病毒抗原來檢測病人血清中有無相應(yīng)抗體，故須待病人感染后體內(nèi)產(chǎn)生抗體時才能檢出。 另外，在采取臨床標本及病人血清應(yīng)注意病程，必須采取患者急性期血清與恢復(fù)期血清 (雙份血清) 進行血清學(xué)試驗。若第2次血清抗體滴度比第1次高出4倍以上時，才有診斷意義。,2.中和試驗(ne

11、utralizing test,NT test),是病毒在活體內(nèi)或細胞培養(yǎng)中被特異性抗體中和而失去感染性的一種試驗。 中和抗體是作用于病毒表面抗原 (衣殼或包膜) 的抗體，同種不同型病毒間一般無交叉，特異性高，而且抗體在體內(nèi)維持時間長。中和抗體陽性不一定表示正在感染中，也可能因以前有過隱性感染所致。因此，中和試驗適用于人群免疫情況的調(diào)查，在臨床診斷上較少使用。,1.免疫沉淀法,使Ag-Ab形成不溶性的沉淀。,3.補體

12、結(jié)合試驗 (complement fixation test,CF test),如果反應(yīng)系統(tǒng)中存在待測的抗體（或抗原），則抗原抗體發(fā)生反應(yīng)后可結(jié)合補體；再加入指示系統(tǒng)時，由于反應(yīng)液中已沒有游離的補體而不出現(xiàn)溶血，是為補體結(jié)合試驗陽性。如果反應(yīng)系統(tǒng)中不存在的待檢的抗體（或抗原），則在液體中仍有游離的補體存在，當加入指示系統(tǒng)時會出現(xiàn)溶血，是為補體結(jié)合試驗陰性。因此補體結(jié)合試驗可用已知抗原來檢測相應(yīng)抗體，或用已知抗體來檢測相應(yīng)抗原。,補體結(jié)合

13、試驗圖示,受檢系統(tǒng),指示系統(tǒng),溶血反應(yīng),補體結(jié)合試驗,1、僅有抗原或抗體,,,,,,,,補體,紅細胞,溶血素,陽性,陰性,2、抗原抗體反應(yīng),,,,,,紅細胞,溶血素,陰性,陽性,抗原,抗體,補體,抗原/抗體,,,,,,,5. 酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay 簡稱ELISA ）,以待測抗原（或抗體）與酶標抗體（或抗原）的特異結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過酶活力測定來確定抗原（或抗體）含量。,4

14、.凝膠擴散法,Ag和Ab相遇形成沉降帶。,ELISA的基本類型,先將已知的抗體或抗原結(jié)合在某種固相裁體上，并保持其免疫活性。測定時，將待檢標本和酶標抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)。用洗滌的方法分離抗原抗體復(fù)合物和游離成分。然后加入酶的作用底物催化顯色，進行定性或定量測定。根據(jù)檢測目的和操作步驟不同，有競爭法、雙抗體夾心法、間接法三種類型的常用方法。,此法可用于抗原和半抗原的定量測定，也可用于測定抗體。以測

15、定抗原為例, 將抗原吸附于固相載體；加入待測抗原和一定量特異性抗體，使固相抗原與待測抗原二者競爭與抗體結(jié)合；經(jīng)過洗滌分離，最后結(jié)合于固相的抗體與待測抗原含量呈負相關(guān)。,競爭法,此法常用于測定抗原, 將已知抗體吸附于固相載體, 加入待檢標本(含相應(yīng)抗原)與之結(jié)合。溫育后洗滌，加入酶標抗體和底物進行測定。,雙抗體夾心法,此法是測定抗體最常用的方法。將已知抗原吸附于固相載體，加入待檢標本(含相應(yīng)抗體)與之結(jié)合。洗滌后，加入酶標抗球蛋白抗體(酶

16、標抗抗體)和底物進行測定。,間接法,四、病毒核酸檢測,雜交法 用于病毒檢測的有斑點雜交、細胞內(nèi)原位雜交 、DNA印跡雜交、RNA印跡雜交等。 PCR法 目前多數(shù)病毒基因已通過分子克隆技術(shù)被明確了核苷酸序列，使得DNA擴增技術(shù)逐步發(fā)展為常規(guī)診斷技術(shù)之一。,反轉(zhuǎn)錄PCR,基因芯片技術(shù),又稱DNA芯片、生物芯片（biochip）。 其原理是：將已知的生物分子探針或基因探針，大規(guī)模或有序排布于小塊硅片等載體上，與待測樣品中