帶組氨酸標(biāo)簽的登革病毒2型和4型病毒樣顆粒的表達(dá)鑒定和純化.pdf

1、研究目的： 1.擴(kuò)增編碼登革病毒2型和4型結(jié)構(gòu)蛋白prM和E全基因組序列，構(gòu)建登革病毒樣顆粒重組表達(dá)載體，使其在畢氏酵母中大量表達(dá)病毒樣顆粒，通過(guò)親和層析和蔗糖密度梯度離心方法獲得高純度的VLPs，為研制登革病毒樣顆粒疫苗奠定基礎(chǔ)。 2.分析比較親和層析和蔗糖密度梯度離心兩種VLPs純化方法的優(yōu)缺點(diǎn)，為獲得大量登革病毒樣顆粒提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究方法: 1.登革病毒2型VLPs的表達(dá)和初步鑒定用設(shè)計(jì)的特異引

2、物從DENV2prM和E全基因組cDNA中PCR擴(kuò)增SprME基因，用限制性內(nèi)切酶Bsp1191和XbaI分別切割空載體pGAPZαA質(zhì)粒和上述PCR產(chǎn)物，然后在T4連接酶的作用下將SprME基因和空載體pGAPZαA質(zhì)粒連接成重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入DH5α大腸桿菌內(nèi)，用PCR、酶切及序列測(cè)定的方法鑒定插入表達(dá)質(zhì)粒中的SprME基因序列準(zhǔn)確無(wú)誤后，線性化重組質(zhì)粒通過(guò)電轉(zhuǎn)化的方法把重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入酵母細(xì)胞中，對(duì)發(fā)酵上清和細(xì)胞裂解液分別進(jìn)行SDS—

3、PAGE和Western blotting檢測(cè)目的蛋白。 2.登革病毒4型VLPs的表達(dá)和初步鑒定用設(shè)計(jì)的特異引物從T/A克隆質(zhì)粒中PCR擴(kuò)增prME基因，用限制性內(nèi)切酶XhoI和XbaI分別切割空載體pGAPZαA質(zhì)粒和上述PCR產(chǎn)物，然后在T4連接酶的作用下將prME基因和空載體pGAPZαA質(zhì)粒連接成重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α內(nèi)，用PCR、酶切及序列測(cè)定的方法鑒定插入表達(dá)質(zhì)粒中的prME基因序列準(zhǔn)確無(wú)誤后，用AvrⅡ

4、內(nèi)切酶線性化重組質(zhì)粒通過(guò)電轉(zhuǎn)化的方法把重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入酵母細(xì)胞中。對(duì)發(fā)酵上清和細(xì)胞裂解液進(jìn)行SDS—PAGE檢測(cè)目的蛋白，利用蔗糖梯度離心的方法從細(xì)胞裂解液中分離純化VLPs，并通過(guò)負(fù)染電鏡觀察VLPs。 3.親和層析和蔗糖密度梯度離心純化蛋白的比較分別利用親和層析和蔗糖密度梯度離心的方法對(duì)濃縮的上清液進(jìn)行純化，對(duì)純化蛋白進(jìn)行SDS—PAGE和Westernblotting檢測(cè)鑒定。然后測(cè)定兩種純化方法獲得蛋白的量，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

5、，結(jié)合各自優(yōu)缺點(diǎn)，對(duì)兩種純化蛋白的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。 研究結(jié)果: 1.成功構(gòu)建含prM信號(hào)肽的pGAPA—SprMED2-HIS和載體α信號(hào)肽的pGAPαA—prMED4-HIS兩種重組表達(dá)質(zhì)粒。 2.重組質(zhì)粒pGAPA—SprMED2-HIS電轉(zhuǎn)化入酵母細(xì)胞后，通過(guò)SDS—PAGE和Westernblotting在酵母細(xì)胞裂解液和發(fā)酵上清中分別檢測(cè)到大小約52kDa的目的蛋白條帶。 3.重組質(zhì)粒pGAPZα

6、A—prMED4-HIS電轉(zhuǎn)化入酵母細(xì)胞后，通過(guò)SDS—PAGE在酵母細(xì)胞裂解液和發(fā)酵上清中檢測(cè)到約52kDa的目的蛋白條帶。在裂解液中觀察到直徑30nm的病毒樣顆粒。 4.通過(guò)親和層析和蔗糖密度梯度離心兩種方法純化酵母上清DENV2VLPs，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)兩種方法獲得蛋白量的分析，結(jié)果表明兩種方法無(wú)明顯差異。 結(jié)論: 1.成功構(gòu)建能表達(dá)登革病毒2型和4型病毒樣顆粒的重組載體。 2.在信號(hào)肽的引導(dǎo)下，成