腫瘤干細胞在人黑色素瘤細胞系A(chǔ)375耐順鉑效應(yīng)中的作用.pdf

1、研究背景：
　　皮膚惡性黑色素瘤是常見的一種惡性腫瘤，順鉑（cisplatin，CDDP）是治療皮膚惡性黑色素瘤的主要化療藥物。皮膚黑色素瘤細胞對 CDDP的敏感性較低，容易對CDDP產(chǎn)生獲得性耐藥，其機制目前尚不明確。盡管許多研究對皮膚惡性黑色素瘤的耐藥性進行了細致的探討，但是腫瘤干細胞（cancer stemcells，CSCs）在上述過程中的作用并不清楚。CSCs是腫瘤組織包含的具有自我更新和分化能力的一小類細胞，對腫瘤的發(fā)

2、生發(fā)展起著重要的作用，被認為是產(chǎn)生腫瘤組織的細胞。多項研究表明，CSCs是多種腫瘤細胞對化療耐藥的重要機制之一。由此我們推測，CSCs有可能是皮膚惡性黑色素瘤對CDDP產(chǎn)生耐藥性的機制之一。
　　為確定CSCs是否參與了皮膚惡性黑色素瘤對CDDP的耐藥過程，本研究首先采用人黑色素瘤細胞系A(chǔ)375建立了耐CDDP的人黑色素瘤細胞系（CDDP-R A375），鑒定了CDDP-R A375對CDDP的耐藥性，檢測了干細胞標(biāo)記物的表達和C

3、DDP-R A375的多藥耐藥性，采用As2O3逆轉(zhuǎn)了CDDP-R A375的耐藥性后，再次檢測了干細胞標(biāo)記物的表達和CDDP-R A375的多藥耐藥性。
　　實驗方法：
　　1.采用大劑量沖擊和逐步增加劑量相結(jié)合的方法誘導(dǎo)人惡性皮膚黑色素瘤耐藥細胞系CDDP-R A375。
　　2.采用細胞計數(shù)法檢測了CDDP-R A375細胞的增殖能力。
　　3.采用MTT法觀察了CDDP-R A375和正常A375（WTA

4、375）細胞對CDDP、氮烯咪胺（dacarbazine,DTIC）和紫杉醇的敏感性。
　　4.熒光實時定量PCR檢測了SOX-2、OCT-4和CD133在CDDP-R A375和WT A375細胞的表達。
　　5.MTT法檢測了As2O3對CDDP-R A375和WT A375細胞的毒性。
　　6.As2O3（0.2mg/L）預(yù)處理后，MTT法觀察了CDDP-R A375細胞對CDDP、氮烯咪胺（dacarbazin

5、e,DTIC）和紫杉醇敏感性的變化，并采用熒光實時定量PCR檢測了SOX-2、OCT-4和CD133在CDDP-R A375細胞表達的變化。
　　實驗結(jié)果：
　　1.同WT A375細胞比較，CDDP-R A375細胞的增殖能力無顯著改變（P>0.05）。CDDP-R A375和WT A375細胞的倍增時間分別為38.5 h和36.2 h，兩者無明顯差異。
　　2.在含有CDDP（4mg/L）的培養(yǎng)液中，在第3、4、5

6、和6d，CDDP-R A375細胞的增長速率顯著高于WT A375細胞（P<0.05），在第1和2d，兩種細胞之間的生長速率無顯著差異（P>0.05）。同正常培養(yǎng)液中的WT A375細胞比較，含CDDP（4mg/L）培養(yǎng)液培養(yǎng)的CDDP-RA375細胞的增殖速率無顯著改變（P>0.05）；CDDP濃度為0.004和0.04mg/L時，CDDP-R A375和WT A375細胞增長速率無顯著差異（P>0.05），但是CDDP濃度為0.4、

7、4和40mg/L時，CDDP-R A375細胞的生長速率顯著高于WT A375細胞（P<0.01）；CDDP-R A375和WT A375對CDDP的IC50分別為62.9mg/L和4.23mg/L，耐藥指數(shù)為14.87。
　　3.細胞培養(yǎng)液中的DTIC濃度在0.01、0.1和1mg/L時，CDDP-R A375和WT A375細胞之間的生長率無顯著差異（P>0.05），DITC濃度增加為10和100mg/L時，CDDP-R A3

8、75細胞的生長率顯著高于WT A375細胞（P<0.05），CDDP-R A375和WT A375對DTIC的IC50分別為1881mg/L和293mg/L，耐藥指數(shù)為6.42；培養(yǎng)液中的紫杉醇濃度在0.001和0.01mg/L時，CDDP-R A375和WT A375細胞之間的生長率無顯著差異（P>0.05），紫杉醇濃度增加為0.1、1和10mg/L時，CDDP-R A375細胞的生長率顯著高于WT A375細胞（P<0.05），CD

9、DP-R A375和WT A375對紫杉醇的IC50分別為8.2mg/L和1.6mg/L，耐藥指數(shù)為5.13。
　　4.相對于WT A375細胞，CDDP-R A375細胞中SOX-2、OCT-4和CD133的表達均顯著增加（P<0.05）。
　　5.0.25 mg/L的As2O3對CDDP-R A375和WTA375細胞無毒性反應(yīng)，但是當(dāng)濃度超過0.25mg/L時，As2O3呈現(xiàn)出劑量依賴性的毒性效應(yīng)。
　　6.0.

10、20 mg/L的As2O3降低了CDDP-R A375對CDDP的耐藥性，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為1.81，相對逆轉(zhuǎn)效率為47.5％；0.20 mg/L的As2O3降低了CDDP-R A375對DTIC的耐藥性，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為1.63，相對逆轉(zhuǎn)效率為44.3%；0.20 mg/L的As2O3降低了CDDP-R A375對紫杉醇的耐藥性，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為1.57，相對逆轉(zhuǎn)效率為43.7%；0.20 mg/L的As2O3預(yù)處理后，CDDP-R A375細胞中SOX