黑色素瘤小鼠高轉移模型體內篩選和細胞系的建立.pdf

1、目的：采用深度免疫缺陷動物，并通過手術切除腫瘤進行高轉移模型體內綜合篩選的實驗思路，建立鼠源和人源黑色素瘤小鼠高轉移模型及相應細胞系，同時觀察相關生物學特性，探討轉移相關機理，為腫瘤的預防、診斷和治療等提供理想的動物模型。 方法：1.小鼠黑色素瘤高轉移模型的體內篩選和細胞系的建立： 將小鼠黑色素瘤B16移植于T、B、NK細胞聯(lián)合免疫缺陷的BNX小鼠皮下，首先進行皮下移植→手術切除→肺轉移→皮下移植的連續(xù)三代體內篩選，再按

2、照皮下移植→肺轉移→皮下移植的方法繼續(xù)進行三代篩選，建立移植性自發(fā)高轉移模型，同時進行腫瘤的生長、轉移情況和病理組織學的觀察。采用組織塊法對小鼠黑色素瘤高轉移腫瘤組織進行原代培養(yǎng)及建立細胞系，觀察腫瘤細胞的形態(tài)學、生長速度、體外侵襲能力、染色體形態(tài)分析、細胞周期變化、體內驗證皮下移植的成瘤率和轉移情況。 2.人黑色素瘤高轉移模型的體內篩選及微轉移動態(tài)檢測： 利用人黑色素瘤A357細胞株進行SCID小鼠皮下移植實驗時，發(fā)現(xiàn)

3、6只動物中有1只發(fā)生明顯肺轉移，取肺轉移灶移植至SCID小鼠皮下擴增。采用皮下移植→肺轉移→皮下移植體內反復篩選的方法，建立皮下移植小鼠肺高轉移動物模型(血路轉移合并淋巴道轉移)及相應的人黑色素瘤高轉移細胞系，并進行相關生物學特性的初步研究。同時應用該細胞系建立BNX小鼠皮下移植瘤模型，通過Alu-PCR進行動態(tài)、定性的肺微轉移檢測。 結果：1.小鼠黑色素瘤高轉移模型的體內篩選和細胞系的建立： 通過體內綜合篩選，成功建立

4、了BNX小鼠B16黑色素瘤皮下移植腫高轉移模型。該模型的皮下移植成瘤率可達100％，35d時肺轉移率達到91.7％(1l/12)，轉移程度達到+++。同時建成相應的高轉移細胞系，將其命名為B16-sci，其倍增時間為46.07h，自然凋亡率顯著低于B16細胞(19<0.05)，體外侵襲能力顯著強于B16細胞(P<0.05)，染色體分析結果表明B16-sci細胞符合小鼠惡性腫瘤細胞染色體的特點。體內驗證結果表明，B16-sci細胞移植于B

5、NX小鼠皮下，已能穩(wěn)定形成100％(6/6)肺轉移，同時提高了該細胞在C57BL/6J小鼠皮下移植后的肺轉移率。 2.人黑色素瘤SCI-375高轉移模型的篩選及微轉移動態(tài)檢測： 經(jīng)體內反復篩選，成功建立了皮下移植小鼠肺轉移動物模型(血路轉移合并淋巴道轉移)。潛伏期從篩選初期的7-14天逐漸縮短至5天左右，荷瘤壽命從60—75天下降并穩(wěn)定在45天左右。篩選傳代的243只SCID小鼠，皮下100％成瘤，肺轉移率隨著篩選的進行

6、，逐代提高，第6代起腫轉移率保持在100％。建成了相應的高轉移細胞系，并將其命名為SCI-375，其倍增時間為21.60h，體外侵襲能力強于未篩選的A375(P<0.05)，染色體分析結果顯示該細胞具有人類惡性腫瘤細胞染色體的特點。體內驗證結果表明：SCI-375在不同免疫缺陷動物體內均能表達較高的轉移率，BNX小鼠肺轉移率為100％(13/13)，裸小鼠肺轉移率為90.91％(10/11)。Alu-PCR結果顯示：2W時，PCR檢測和

7、常規(guī)病理檢測肺轉移均為陰性；3w、4W、5w時，PCR檢測肺轉移率分別為(37.5％)3/8、(75％)6/8、(100％)10/10，常規(guī)病理檢測肺轉移率分別為(0％)0/8、(37.5％)3/8、(50％)5/10。可見，分子生物學的方法可以早期檢測腫瘤微轉移情況的發(fā)生，其靈敏度和高效性要優(yōu)于常規(guī)病理檢測。 結論：1.利用深度免疫缺陷動物以及手術切除腫瘤進行高轉移模型的體內篩選的實驗思路，成功建立了一個肺轉移率高、轉移特性穩(wěn)