豬乳鐵蛋白肽的分子改良及改良肽的作用機制、生物學功能和重組表達研究.pdf

1、豬乳鐵蛋白肽(Porcine lactoferricin-20，LFP-20)是來源于豬乳鐵蛋白N端含20個氨基酸殘基的陽離子抗菌肽。本研究以LFP-20為模板，通過分子設計對其進行改良。在此基礎上研究了改良肽的抗菌活性和安全性，比較了改良抗菌肽LF-2、LF-4、LF-6與LFP-20在膜作用機制方面的差異；通過建立小鼠腿肌和腹腔大腸桿菌染菌模型，研究了改良抗菌肽LF-2、LF-6對小鼠感染大腸桿菌的保護作用，同時探討了改良抗菌肽對健

2、康小鼠和染菌小鼠免疫功能的影響；進一步利用大腸桿菌和畢赤巴斯德酵母表達系統(tǒng)成功表達了改良抗菌肽LF-6。主要研究結果如下：
　　 1.豬乳鐵蛋白肽的分子改良及改良肽的篩選
　　 在分析LFP-20理化性質、氨基酸組成并對其進行結構預測的基礎上，采用去除分子內二硫鍵、改變疏水性和芳香族氨基酸比例等策略對豬乳鐵蛋白肽LFP-20進行分子改良，獲得了8種改良肽。對改良肽抗菌活性研究結果表明：與模板肽LFP-20相比，改良肽LF

3、-2、LF-4和LF-6對革蘭氏陰性菌大腸桿菌、銅綠假單胞菌、豬霍亂沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的抗菌活性提高了2～64倍，對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的抗菌活性提高了2～8倍，其中，以改良肽LF-6的抗菌活性最好。與模板肽LFP-20相比，在0-32μg/mL范圍內三種改良肽對人和豬的紅細胞溶血率沒有顯著增加(p>0.05)。與模板肽LFP-20相比，0～50μg/mL的改良肽LF-2、LF-4、LF-6對人和豬的外周血單核

4、細胞增殖沒有顯著差異(p>0.05)；在0～32μg/mL范圍內，除8μg/mL和16μg/mL的LF-4以外，改良肽LF-2、LF-4、LF-6對外周血單核細胞的細胞毒性也沒有顯著增加(p>0.05)。
　　 2.豬乳鐵蛋白肽及改良肽的膜作用機制研究
　　 掃描電鏡和透射電鏡觀察LFP-20及其改良肽LF-2、LF-4、LF-6對E.coli和S.aureus細胞形態(tài)影響結果表明，1×MIC的LFP-20及三種改良肽作

5、用細菌30 min后，對細菌細胞膜結構均有破壞作用，能夠導致細胞膜產生不同程度的突起或破損，菌體細胞壁及細胞膜斷裂、細胞內容物泄漏，細胞質電子密度明顯降低，表明細菌細胞膜是這些抗菌肽作用的重要靶點。在相同濃度下，三種改良肽LF-2、LF-4、LF-6對E.coli和S.aureus細胞膜產生的去極化作用明顯強于模板肽LFP-20，更容易導致細胞膜電勢的破壞。8μg/mL～32μg/mL的三種改良肽對E.coli細胞外膜滲透性的增強作用均

6、顯著高于模板肽LFP-20(p<0.05)；與LFP-20、LF-2、LF-4相比，LF-6導致E.coli細胞內膜滲透性的增加作用最為迅速、明顯。LFP-20、LF-4和LF-6對DPX與LPS結合的最大抑制率與相近，分別為68％、56％和51％，達到50％抑制率時所需的LF-4和LF-6濃度卻明顯低于LFP-20，分別為7.96μg/mL和6.91μg/mL，而LFP-20達到50％抑制率時所需的濃度為17.30μg/mL；LF-4

7、、LF-6置換DPX-LPS分子中DPX，結合LPS的能力稍弱于LFP-20，但實現(xiàn)與LPS最大結合所需肽濃度卻明顯低于LFP-20。16μg/mL和32μg/mL的四種抗菌肽對脂質體膜具有相似的破壞潛能，但與模板肽LFP-20相比，64μg/mL的三種改良肽對脂質體膜PC：PG(1:1)和PG呈現(xiàn)了更強的破壞作用，引發(fā)了40％以上鈣黃綠素的釋放。上述研究結果揭示，膜破壞機制是LFP-20及其三種改良肽對E.coli和S.aureus的

8、主要殺菌機制；與LFP-20相比，LF-2、LF-4、LF-6提高的抗菌活性可能它們增強的對細菌細胞膜去極化作用、對細菌細胞內外膜滲透性、更容易與LPS結合以及對脂質體膜的破壞潛能密切相關。
　　 3.豬乳鐵蛋白肽及改良肽對小鼠感染大腸桿菌保護作用的研究
　　 在研究LFP-20及其改良肽LF-2、LF-6對ICR小鼠急性毒性的基礎上，建立了ICR小鼠腿肌和腹腔大腸桿菌感染模型，比較了LFP-20與改良肽LF-2、LF-

9、6抵抗小鼠感染大腸桿菌的能力。急性毒性研究結果表明，LFP-20、LF-2、LF-6對ICR小鼠的LD50分別為34.25 mg/kg、16.54 mg/kg和29.52 mg/kg。腿肌感染E.coli K88試驗結果表明，2mg/kg和8 mg/kg的三種抗菌肽對小鼠腿肌染菌都具有預防效果，除2 mg/kg LFP-20外，另外五種劑量的抗菌肽均顯著降低了小鼠腿肌E.coli活菌數(shù)(P<0.05)；其中，8 mg/kgLF-6對小鼠

10、腿肌染菌的抑制效果最為顯著(p<0.05)，該組小鼠腿肌勻漿組織中的活菌數(shù)為3.85±0.24(1g CFU/g)。預防腹腔感染E.coli K88試驗結果表明：與E.coli組相比，2 mg/kg和8 mg/kg的三種抗菌肽對染菌小鼠腹腔液、肝臟和腸系膜淋巴結感染的大腸桿菌都具有顯著的抑制效果(p<0.05)，其中以8 mg/kg LF-6的抑菌效果最好，其腹腔液、肝臟和腸系膜淋巴結中大腸桿菌活菌數(shù)分別為1.18±0.10(1g CF

11、U/mL)、3.85±0.24(1g CFU/g)和3.00±0.15(1g CFU/g)。E.coli組盲腸內容物中大腸桿菌、乳酸菌和雙歧桿菌活菌數(shù)分別為5.57±0.16(1g CFU/g)、6.32±0.09(1g CFU/g)和5.54±0.17(1gCFU/g)；各抗菌肽組的大腸桿菌(除2 mg/kg LFP-20外)均顯著低于E.coli組(p<0.05)，乳酸菌數(shù)和雙歧桿菌數(shù)(除8 mg/kg LFP-20外)均顯著高于E

12、.coli組(p<0.05)。E.coli組糞便中大腸桿菌、乳酸菌和雙歧桿菌活菌數(shù)分別為6.07±0.09(1g CFU/g)、5.88±0.04(1g CFU/g)和5.88±0.04(1g CFU/g)，各抗菌肽組糞便大腸桿菌活菌數(shù)均顯著低于E.coli組(p<0.05)；2 mg/kg LF-2組的乳酸菌數(shù)顯著高于E.coli組(p<0.05)；六個抗菌肽組的雙歧桿菌數(shù)均顯著高于E.coli組(p<0.05)。上述研究結果揭示，L

13、FP-20及改良肽LF-2、LF-6可以通過體內抑菌作用增強小鼠抵抗E.coli K88感染能力，同時，能夠改善由于感染引起的腸道雙歧桿菌和乳酸菌數(shù)量降低，并且改良肽LF-2和LF-6的體內抑菌效果好于模板LFP-20。
　　 4.豬乳鐵蛋白肽及改良肽對小鼠免疫功能影響的研究
　　 LFP-20及改良肽LF-2、LF-6對ICR小鼠免疫功能影響的研究結果表明：與正常對照組小鼠相比，2 mg/kg的LF-2和LF-6顯著增

14、加了小鼠的胸腺指數(shù)(p<0.05)，而8 mg/kg的LF-2和LF-6顯著降低了小鼠的胸腺指數(shù)(p<0.05)和脾臟指數(shù)(p<0.05)：8 mg/kg LF-6顯著提高了外周血淋巴細胞百分率(p<0.05)，2 mg/kg LF-6顯著提高了小鼠外周血白細胞總數(shù)；2 mg/kg的LFP-20、LF-2、LF-6和8 mg/kg LF-2、LF-6顯著降低了小鼠外周血CD3+CD4+淋巴細胞的比例，2 mg/kg LF-2、LF-6和

15、8 mg/kg LF-2顯著增加了小鼠外周血中的B細胞比例(p<0.05)，但對NK細胞的數(shù)量沒有顯著影響；8 mg/kg LF-2和2 mg/kg LF-6組小鼠脾臟淋巴細胞的LPS刺激指數(shù)和ConA刺激指數(shù)顯著升高(p<0.05)。
　　 LFP-20及改良肽LF-2、LF-6對E.coli K88感染小鼠免疫功能影響的研究結果表明：與正常對照組相比，E.coli組小鼠的胸腺指數(shù)顯著降低，2 mg/kg的LF-2、LF-6和

16、8 mg/kg的LFP-20、LF-2均有使感染小鼠胸腺指數(shù)升高的趨勢(p<0.05)。與正常對照組相比，E.coli組小鼠的外周血淋巴細胞百分率有所增加(p<0.05)；與E.coli組相比。六個抗菌肽組的外周血淋巴細胞百分率均顯著降低(p<0.05)。與正常對照組相比，E.coli組小鼠的外周血CD3+CD8+細胞的比例顯著降低，CD3+CD4+和CD3+CD8+細胞的比值顯著升高，NK細胞的比例顯著降低；2 mg/kg的LFP-2

17、0、LF-6和8 mg/kg的LFP-20、LF-2使小鼠外周血CD3+CD8+細胞的比例顯著高于E.coli組(p<0.05)；與E.coli組小鼠相比，8mg/kg LF-2顯著提高了小鼠外周血中NK細胞的比例(p<0.05)。E.coli組小鼠脾臟淋巴細胞的LPS刺激指數(shù)和ConA刺激指數(shù)均顯著高于正常對照組(p<0.05)；六個抗菌肽組的LPS刺激指數(shù)和ConA刺激指數(shù)均顯著低于E.coli組；與正常對照組相比，2 mg/kg和

18、8 mg/kg LFP-20組小鼠脾臟淋巴細胞的LPS刺激指數(shù)顯著升高(p<0.05)；2 mg/kgLFP-20組ConA刺激指數(shù)顯著升高(p<0.05)。與正常對照組相比，E.coli組小鼠脾細胞的抗體生成能力沒有顯著變化，但2 mg/kg的三種抗菌肽和8 mg/kg的LF-2、LF-6使小鼠脾細胞的抗體生成能力顯著提高(p<0.05)。與正常對照組相比，E.coli組細胞因子IL-1、IL-10、TNF-α和趨化因子MCP-1、M

19、IP-1α基因表達水平顯著升高(p<0.05)；LF-2降低了由E.coli感染導致的MCP-1、MIP-1α、IL-10基因表達水平升高(p<0.05)，顯著增加了IFN-γ基因表達水平(p<0.05)；與E.coli組相比，2 mg/kg LF-6顯著降低由E.coli感染導致的MCP-1、MIP-1α、和IL-10基因表達水平；8 mg/kg LF-6顯著降低了由E.coli感染導致的MCP-1、MIP-1α、IL-1、IL-10

20、和TNF-α基因表達水平(p<0.05)。
　　 5.豬乳鐵蛋白肽改良肽的重組表達研究
　　 改良抗菌肽LF-6在大腸桿菌中的重組表達。根據大腸桿菌密碼子偏好性及改良肽LF-6的氨基酸序列設計引物，并通過套疊PCR成功擴增目的基因EK-LF-6及TEV-LF-6，將目的基因構建至表達載體pET32a，成功構建了大腸桿菌重組菌株BL21(DE3)pLysS-pET32a-TEV-LF-6和BL21(DE3)pLysS-pE

21、T32a-EK-LF-6，經誘導表達和SDS-PAGE分析，融合蛋白Trx-EK-LF-6及Trx-TEV-LF-6均有明顯表達；Bradford法蛋白定量、凝膠條帶分析及計算獲得可溶性融合蛋白Trx-TEV-LF-6及Trx-EK-LF-6的表達量分別為40.60 mg/L和42.13 mg/L；兩種融合蛋白經蛋白酶切割后，目標抗菌肽LF-6的理論表達量分別為5.59 mg/L，和6.13 mg/L。對兩種融合蛋白進行分離純化及TEV

22、酶和EK酶切割相應融合蛋白，結果表明TEV酶的切割效率高于EK酶。對切割產物進行冷凍干燥濃縮并使用瓊脂糖孔穴擴散法檢測其活性，結果表明TEV酶切割融合蛋白的產物對E.coli K88及ATCC25922具有一定抑菌活性，且對E.coli K88的抗菌活性強于對大腸桿菌ATCC25922，該結果表明經過TEV酶切割后殘留在LF-6N端的Gly對LF-6活性的影響較小。
　　 改良抗菌肽LF-6在巴斯德畢赤酵母中的重組表達。根據酵母

23、偏愛密碼子及LF-6氨基酸序列設計引物，通過套疊PCR擴增獲得目的基因后，將其構建至誘導型分泌表達載體pPICZαA，重組質粒PICZα-LF-6轉化蛋白酶缺陷型酵母菌株SMD1168構建重組菌株SMD1168-pPICZaA-LF-6，經甲醇誘導重組菌株表達目標抗菌肽LF-6；取發(fā)酵上清進行Trieine-SDS-PAGE檢測結果表明，重組菌株誘導6天后目的肽LF-6表達量達較高水平；對發(fā)酵液上清進行濃縮后，Bradford法測定LF

24、-6的表達量為20 mg/L。瓊脂糖孔穴擴散法對抑菌活性的檢測結果表明重組表達的LF-6對E.coli K88具有一定的抑菌活性。
　　 綜上所述，本論文通過對LFP-20的分子改良，獲得了對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌抗菌活性明顯提高且在一定濃度范圍內對紅細胞溶血率和外周血單核細胞毒性沒有顯著增強的改良肽LF-2和LF-6；與模板肽LFP-20相比，改良肽LF-2和LF-6對細菌具有更強的破膜作用機制，并可以通過體內抑菌作用增強