轉(zhuǎn)基因奶山羊乳汁中重組人乳鐵蛋白的分離純化與生物學(xué)活性分析.pdf

1、轉(zhuǎn)基因奶山羊乳汁中重組人乳鐵蛋白的分離純化與生物學(xué)活性分析StudiesontheseparationandpurificationandbiologicalactivityoftransgenicgoatofrhLFinthemilk研究生：劉吳指導(dǎo)老師：成勇教授劉吳轉(zhuǎn)基因奶山羊乳汁中重組人乳鐵蛋白的分離純化與生物學(xué)活性分析中文摘要人乳鐵蛋白(hLF)是一種具有廣泛的生物學(xué)活性的鐵結(jié)合糖蛋白。hLF基于其獨(dú)特的生物學(xué)功能和理化性質(zhì)，已

2、廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療、飼料添加劑等領(lǐng)域。然而，由于hLF來(lái)源的匱乏及加工過(guò)程造成的污染，使得其大規(guī)模的應(yīng)用受到了限制。而乳腺生物反應(yīng)器相對(duì)于傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，具有以較低的成本生產(chǎn)大量的活性蛋白的潛能。因此，利用基因工程技術(shù)開(kāi)發(fā)重組人乳鐵蛋白(rhLF)成為研究的熱點(diǎn)和發(fā)展趨勢(shì)。在前期的研究工作中，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了含有人乳鐵蛋白cDNA的rhLF乳腺特異性表達(dá)載體，獲得了乳腺特異性表達(dá)rhLF的轉(zhuǎn)基因奶山羊。本研究選用了其中兩只rhLF

3、轉(zhuǎn)基因奶山羊(L64、L31)的羊乳汁，經(jīng)過(guò)分離純化，鑒定其是否與hLF具有相一致的生物學(xué)活性。分別收集轉(zhuǎn)基因奶山羊L64、L31羊乳汁，離心去除脂肪，酸化沉淀去除酪蛋白，獲得乳清。將乳清利用三次硫酸銨沉淀法最終得到沉淀物用超純水溶解，溶解后的溶液用PBS(PH74)作為透析液透析24h，再經(jīng)PEG20000濃縮至30mg／ml后進(jìn)行Westemblotting檢測(cè)。將上述濃縮后的溶液稀釋至20mg／ml，以進(jìn)樣量為4ml，流速為05m

4、l／min，緩沖液PH值為74的條件進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析以獲得rhLF。將通過(guò)凝膠過(guò)濾層析獲得的rhLF經(jīng)Westernblotting免疫檢測(cè)后稀釋至2mg／ml，取109L滴加到直徑6mm的濾紙片上，紫外燈照射后放置在涂布大腸桿菌菌液的平皿中，37。C恒溫培養(yǎng)14～16h后檢測(cè)抑菌圈大小。將通過(guò)凝膠過(guò)濾層析獲得的rhLF與適量的TrisHCL緩沖液、NaHC03溶液及Fe(NH4)2(S04)2“6H20溶液混合，25。C反應(yīng)10min

5、，通過(guò)紫外分光光度計(jì)對(duì)上述混合液進(jìn)行全光譜掃描。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，利用硫酸銨沉淀法最終獲得的rhLF經(jīng)Westernblotting檢測(cè)，可特異性的與兔抗hLF抗體結(jié)合，且具有與hLF分子量相一致的條帶。通過(guò)凝膠過(guò)濾層析收集到的各個(gè)洗脫峰峰值處的洗脫液，經(jīng)Westemblotting檢測(cè)，rhLF均在第一個(gè)洗脫峰處被分離得到。對(duì)大腸桿菌的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相同蛋白濃度(2mg／m1)的rhLF和hLF均能產(chǎn)生抑菌圈，對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)具有明顯