成年山羊乳腺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染人乳鐵蛋白基因及細(xì)胞株的建立.pdf

1、乳腺生物反應(yīng)器是當(dāng)前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)課題，從理論上講，乳腺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染乳腺特異性表達(dá)融合基因，再進(jìn)行核移植是可行的，但國內(nèi)外成功的報(bào)道極少。在體細(xì)胞核移植和乳腺生物反應(yīng)器制作成功報(bào)道的基礎(chǔ)之上，本課題將乳腺特異性表達(dá)載體的構(gòu)建、奶山羊乳腺上皮細(xì)胞(GMFC)系的建立、外源基因轉(zhuǎn)染奶山羊乳腺上皮細(xì)胞及轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立等幾個方面結(jié)合起來，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞核移植的相關(guān)研究，通過前期細(xì)胞水平的整合和表達(dá)檢測，挑選陽性細(xì)胞株進(jìn)行克隆羊的制作，旨在

2、降低乳腺生物反應(yīng)器的制作成本，從而搭建一個可行的制作轉(zhuǎn)基因動物的平臺，利于進(jìn)一步的科學(xué)研究和實(shí)際應(yīng)用。 1乳腺特異性表達(dá)載體的構(gòu)建 本實(shí)驗(yàn)利用實(shí)驗(yàn)室已有的人乳鐵蛋白cDNA、奶山羊β-乳球蛋白(β-BLG)5`端(4.2Kb)、3`端(1.8Kb)表達(dá)調(diào)控序列、Neor、增強(qiáng)子序列構(gòu)建出乳腺特異性表達(dá)載體BLC-14。 2奶山羊乳腺上皮細(xì)胞系的建立 本實(shí)驗(yàn)用胰蛋白酶組織消化液乳導(dǎo)管注射消化、細(xì)胞收集法和乳

3、腺組織塊膠原酶消化兩種方法從泌乳奶山羊的乳腺實(shí)質(zhì)組織中分離得到原代乳腺上皮細(xì)胞，DMEM/F12培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)。對兩種方法取的細(xì)胞的生長狀況進(jìn)行比較，結(jié)果顯示胰蛋白酶直接消化法獲得的細(xì)胞在體外培養(yǎng)至10代左右，細(xì)胞開始衰老；膠原酶消化法獲得的細(xì)胞在體外培養(yǎng)25代以上仍能保持旺盛的生命力，但上皮細(xì)胞中含成纖維樣細(xì)胞混合生長，傳代時采用分步胰酶消化反復(fù)貼壁法，經(jīng)2～3次的選擇傳代可獲得比較純的乳腺上皮細(xì)胞系。 3人乳鐵蛋白基因轉(zhuǎn)染奶

4、山羊乳腺t-皮細(xì)胞及細(xì)胞株的建立 通過電轉(zhuǎn)染法將含有Neor標(biāo)記基因的BLC-14載體基因片段導(dǎo)入奶山羊乳腺上皮細(xì)胞，經(jīng)G418(400μg/ml)篩選培養(yǎng)三周后，得到有抗性的細(xì)胞株，挑取單克隆株并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，共73株。經(jīng)PCR檢測，確認(rèn)31株細(xì)胞為轉(zhuǎn)染了外源基因的細(xì)胞株。對轉(zhuǎn)染有外源基因的細(xì)胞株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分別收集誘導(dǎo)48小時和72小時的誘導(dǎo)液進(jìn)行ELISA檢測，在誘導(dǎo)48小時和72小時的誘導(dǎo)液中分別有11株細(xì)胞的誘導(dǎo)液中