兩種沼蝦溶菌酶基因的克隆與羅氏沼蝦溶菌酶基因的組織表達(dá)分析.pdf

1、近年來(lái)頻繁爆發(fā)的蝦類(lèi)病害引起了人們對(duì)蝦類(lèi)自身免疫機(jī)制的重視。目前普遍認(rèn)為蝦類(lèi)和其它無(wú)脊椎動(dòng)物一樣，體液中不具有免疫球蛋白，缺乏脊椎動(dòng)物所具有的特異性免疫機(jī)制，主要依靠體內(nèi)的非特異性免疫因子抵抗外來(lái)病原的入侵。溶菌酶是生物體內(nèi)重要的非特異免疫因子之一，在引發(fā)和維持機(jī)體防御免疫的過(guò)程中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)克隆了羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）、日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)溶菌酶基因

2、cDNA，并以重組羅氏沼蝦溶菌酶Lyz-T質(zhì)粒作為模板，PCR法制備羅氏沼蝦溶菌酶基因的生物素標(biāo)記探針，用Northern Dot Blot方法檢測(cè)羅氏沼蝦正常和弧菌感染個(gè)體各組織中的溶菌酶基因的表達(dá)情況，初步評(píng)價(jià)其免疫防御功能，為進(jìn)一步開(kāi)展蝦類(lèi)的免疫防御分子機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。 1 兩種沼蝦溶菌酶基因ORF的克隆與序列分析 　本實(shí)驗(yàn)參考多種生物類(lèi)群的溶菌酶基因序列，設(shè)計(jì)并合成引物。分別提取羅氏沼蝦和日本沼蝦血細(xì)胞總RNA

3、。以此總RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增獲得特異性cDNA片段，純化后克隆到T載體上。重組子序列測(cè)定表明，所克隆的2種沼蝦溶菌酶基因的開(kāi)放閱讀框（ORF）均為477bp，編碼158個(gè)氨基酸，包括成熟肽140個(gè)氨基酸殘基和信號(hào)肽18個(gè)氨基酸殘基。同源性分析表明，所克隆的2種沼蝦溶菌酶的基因序列和推測(cè)氨基酸序列之間都具有較高同源性，分別為99.4％和98.1％；與已在GenBank上登錄的對(duì)蝦溶菌酶基因的同源性為80％以上。與人、雞、魚(yú)、按蚊

4、等不同生物類(lèi)群的c-型溶菌酶的推測(cè)氨基酸序列同源性也高于30％。2種沼蝦溶菌酶都具有c-型溶菌酶保守的兩個(gè)酶活性位點(diǎn)谷氨酸殘基（Glu51）和天門(mén)冬氨酸殘基（Asp68），以及保守的8個(gè)半胱氨酸殘基（Cys），因而推測(cè)所克隆的2種沼蝦溶菌酶基因?qū)賑-型溶菌酶基因。同時(shí)，由于所克隆的2種沼蝦溶菌酶缺少c-型溶菌酶的鈣結(jié)合亞型所特有的3 個(gè)保守的天門(mén)冬氨酸殘基（Asp），可認(rèn)為這兩種沼蝦溶菌酶基因?qū)儆赾-型溶菌酶的非鈣結(jié)合亞型。 2

5、 羅氏沼蝦溶菌酶基因的組織表達(dá)分析 2．1 羅氏沼蝦溶菌酶基因正常個(gè)體的組織分布 用PCR法制備了生物素標(biāo)記的內(nèi)參照18S rRNA基因探針和溶菌酶基因探針，并利用此探針與各組織總RNA樣品進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，結(jié)果顯示羅氏沼蝦溶菌酶基因在眼、肌肉、鰓、肝胰腺、血細(xì)胞、腸管等組織中均有表達(dá)，但表達(dá)量不同。其中在腸管中的表達(dá)量最高，肝胰腺次之，肌肉中的表達(dá)量最低。 2．2 羅氏沼蝦溶菌酶基因在感染個(gè)體不同組織中的表達(dá)

6、 斑點(diǎn)雜交檢測(cè)受弧菌感染的羅氏沼蝦個(gè)體溶菌酶基因在各組織中的表達(dá)，結(jié)果表明受感染后6h,在蝦的眼、肌肉、鰓、肝胰腺、腸管等組織中溶菌酶基因的表達(dá)量均有升高，其中以肝胰腺中的表達(dá)量最高，約為對(duì)照組的5.6倍。在血細(xì)胞中的表達(dá)量稍有降低。 2．3 羅氏沼蝦溶菌酶基因在肝胰腺中的表達(dá)隨感染時(shí)間的變化 在不同的感染時(shí)間里，肝胰腺中溶菌酶基因表達(dá)量有較大的變化：感染后3h表達(dá)量最低，6h后迅速升高，表達(dá)量約為對(duì)照組的4倍