生物絮團(tuán)對(duì)羅氏沼蝦幼體養(yǎng)殖水體的改良作用及羅氏沼蝦雙順?lè)醋硬《綞LISA檢測(cè).pdf

1、目的：
　　 通過(guò)研究應(yīng)用生物絮團(tuán)技術(shù)的羅氏沼蝦育苗水體各項(xiàng)指標(biāo):氨氮、亞硝酸鹽、溶解氧、葡萄糖殘留、生化需氧量和生物絮團(tuán)含量的變化及水體中的微生物多樣性的變化，闡明不同的葡萄糖添加濃度時(shí)生物絮團(tuán)對(duì)羅氏沼蝦育苗水質(zhì)的影響，初步確定較好的葡萄糖使用濃度，為發(fā)展更經(jīng)濟(jì)環(huán)保的育苗方法提供基礎(chǔ)資料和科學(xué)依據(jù)。同時(shí)，利用羅氏沼蝦雙順?lè)醋硬《就饽さ鞍拙幋a基因VP3，進(jìn)行原核表達(dá)和動(dòng)物免疫，獲得多克隆抗體，初步建立ELISA檢測(cè)方法，為建立該

2、病毒的快速簡(jiǎn)便檢測(cè)方法及雙順?lè)醋硬《镜纳钊胙芯康於ɑA(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.在浙江南太湖淡水水產(chǎn)種業(yè)有限公司進(jìn)行為期27天的育苗實(shí)驗(yàn)，期間對(duì)水體的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行不間斷檢測(cè)，及時(shí)保存后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需的生物絮團(tuán)及蝦苗樣品。
　　 2.根據(jù)實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)的引物對(duì)保存的幼體進(jìn)行羅氏沼蝦雙順?lè)醋硬《綪CR檢測(cè)。利用變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析微生物多樣性變化，確定生物絮團(tuán)技術(shù)對(duì)水體中微生物多樣性的影響。
　　

3、3.根據(jù)羅氏沼蝦雙順?lè)醋硬《镜娜蛐蛄?，選取病毒外膜蛋白VP3的編碼基因，設(shè)計(jì)引物，序列如下:上游F:CGGAATTCATGXAGAGCAATATGCTTCTCTT，下游R: ACGCGTCGACTTACCTGGATGGCCCATAAGT。構(gòu)建克隆載體及表達(dá)載體，獲得可穩(wěn)定表達(dá)蛋白的重組細(xì)菌，獲得表達(dá)蛋白，進(jìn)行動(dòng)物免疫獲得高效價(jià)多克隆抗體血清。
　　 4.通過(guò)不同組ELISA實(shí)驗(yàn)摸索并確定最適抗原包被濃度、包被條件、封閉時(shí)間、

4、孵育時(shí)間、酶標(biāo)二抗作用時(shí)間、顯色時(shí)間和靈敏度等，初步建立羅氏沼蝦雙順?lè)醋硬《镜腅LISA快速檢測(cè)方法。
　　 結(jié)果：
　　 1.各組生物絮團(tuán)含量無(wú)顯著差異。葡萄糖終濃度為20 mg/L組的氨態(tài)氮和亞硝酸氮顯著低于對(duì)照組(T-test，P＜0.05)，溶解氧和化學(xué)需氧量(COD)在試驗(yàn)組與對(duì)照組之間不存在顯著差異。生物絮團(tuán)技術(shù)應(yīng)用于羅氏沼蝦育苗中，對(duì)水體中溶氧含量無(wú)明顯影響，但對(duì)氨氮鹽和亞硝酸氮鹽含量有較高的去除能力。出苗

5、率及生長(zhǎng)測(cè)定表明，對(duì)照組出苗率為32.60％，20 mg/L試驗(yàn)組為60.60％，比對(duì)照組高了85.90％。對(duì)照組仔蝦體長(zhǎng)平均值為8.193 mm，20 mg/L試驗(yàn)組體長(zhǎng)平均值為10.488 mm，比對(duì)照組高了28.00％。
　　 2.2.DGGE結(jié)果顯示，所有組中均檢測(cè)出鹽螺旋藻屬細(xì)菌。除此之外，相較于對(duì)照組，試驗(yàn)組中檢測(cè)出芽孢桿菌屬細(xì)菌，該屬細(xì)菌大部分在水產(chǎn)上隸屬于有益菌。相反對(duì)照組檢測(cè)出氣單胞菌屬細(xì)菌和假單胞菌屬細(xì)菌，且

6、氣單胞菌屬細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)菌群之一。試驗(yàn)組中檢測(cè)出氣單胞菌屬細(xì)菌，但并不是優(yōu)勢(shì)菌群。
　　 3.通過(guò)PCR擴(kuò)增，蛋白重組表達(dá)，抗體制備獲得羅氏沼蝦雙順?lè)醋硬《就饽さ鞍譜P3多克隆抗血清，間接ELISA和Westen-blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示獲得的多克隆抗血清可特異性與重組表達(dá)蛋白及提純病毒間發(fā)生反應(yīng)，且特異性較高。
　　 4.ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，最適抗原包被濃度為1∶100;最適血清使用濃度為1∶8000;最佳包被條件

7、為37℃2h后4℃過(guò)夜;最佳封閉條件為37℃1 h;最佳血清孵育時(shí)間為37℃1 h;最佳酶標(biāo)二抗作用時(shí)間45 min;最佳顯色時(shí)間15 min。應(yīng)用該方法，可以檢出實(shí)驗(yàn)室自備的陽(yáng)性病毒樣品，靈敏度為1∶103。
　　 結(jié)論：
　　 1.生物絮團(tuán)技術(shù)的應(yīng)用可以較好的控制水體中亞硝酸鹽和氨氮的含量，但對(duì)溶解氧及COD的影響不大。生物絮團(tuán)技術(shù)也可以促進(jìn)幼體生長(zhǎng)和提高幼體成活率。
　　 2.生物絮團(tuán)技術(shù)可以改變水體中微生