羅氏沼蝦咽側(cè)體抑制素基因及其天然反義RNA的分子特征與表達(dá)分析.pdf

1、咽側(cè)體抑制素是無(wú)脊椎動(dòng)物中最大的神經(jīng)肽家族之一，在昆蟲(chóng)中它不僅可以抑制保幼激素的合成與釋放，還可以通過(guò)調(diào)節(jié)肌肉的收縮影響其它生理過(guò)程。然而在除昆蟲(chóng)以外的其它任何物種中，均沒(méi)有編碼咽側(cè)體抑制素基因的報(bào)道，更沒(méi)有其基因表達(dá)時(shí)空特征以及相關(guān)調(diào)控因子的研究。 本研究以具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的淡水蝦類(lèi)—羅氏沼蝦(Macrobrachimrosenbergii)作為研究對(duì)象，從其中樞神經(jīng)系統(tǒng)的cDNA文庫(kù)中分別克隆到羅氏沼蝦咽側(cè)體抑制素基因(命名

2、為Macro-ASTA)及其內(nèi)源性天然反義基因(命名為asMacro-ASTA)。Macro-ASTA全長(zhǎng)為2,855bp，編碼一個(gè)由701個(gè)氨基酸殘基組成的咽側(cè)體抑制素前體多肽。如果所有的堿性蛋白酶切位點(diǎn)被識(shí)別剪切，那么這個(gè)前體多肽最少可以形成35個(gè)，29種不同類(lèi)型的咽側(cè)體抑制素。asMacro-ASTA全長(zhǎng)為2,182bp，包含的最大開(kāi)放閱讀框僅由159bp組成。Blast分析發(fā)現(xiàn)沒(méi)有其它已知的基因或蛋白與asMacro-ASTA具

3、有同源性。但是，在其序列內(nèi)部(882bp到1,725bp)存在一段與Macro-ASTA基因3'末端完全反向互補(bǔ)的序列。這是首次在甲殼動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)編碼咽側(cè)體抑制素的基因，同時(shí)，也是在所有已發(fā)現(xiàn)的咽側(cè)體抑制素基因中首次檢測(cè)到它們存在天然反義基因。 另外，運(yùn)用半定量RT-PCR和Southernblottinganalysis等分子生物學(xué)手段分析了Macro-ASTA在羅氏沼蝦體內(nèi)的分布情況和發(fā)育表達(dá)特征，以及在基因組上的拷貝數(shù)。結(jié)果

4、表明：Macro-ASTA在神經(jīng)組織如腦、胸部神經(jīng)節(jié)、腹部神經(jīng)節(jié)和內(nèi)分泌組織如腸中表達(dá)，而在其它組織如心臟、腮、卵巢、肝臟或肌肉組織中均不表達(dá)；雌性羅氏沼蝦從未成熟向成熟階段發(fā)育的過(guò)程中，不論是在胸部神經(jīng)節(jié)還是在腦組織中Macro-ASTA的表達(dá)量都呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，但是在蛻皮后一天表達(dá)量下降，而且在腦組織中，這種增加與下降的趨勢(shì)更加明顯；在雄性羅氏沼蝦的附肢掌節(jié)從白色向黃色轉(zhuǎn)變的過(guò)程中，Macro-ASTA的表達(dá)量在胸部神經(jīng)節(jié)中呈上升趨勢(shì)

5、，在腦組織中呈下降趨勢(shì)；當(dāng)雄蝦附肢掌節(jié)變藍(lán)時(shí)，Macro-ASTA的表達(dá)量在胸部神經(jīng)節(jié)中迅速下降，在腦組織中基本無(wú)表達(dá)；Macro-ASTA在羅氏沼蝦的基因組中以單拷貝形式存在。 最后，為了證明正義基因Macro-ASTA與其天然反義基因asMacro-ASTA之間是否存在相互作用，我們運(yùn)用Northernblottinganalysis以及依賴(lài)于核糖核酸酶保護(hù)分析的RT-PCR等方法證明：asMacro-ASTA在羅氏沼蝦的胸

6、部神經(jīng)節(jié)中有表達(dá)，而Macro-ASTA也在此組織中表達(dá)；在胸部神經(jīng)節(jié)中，Macro-ASTA與asMacro-ASTA的轉(zhuǎn)錄本之間在互補(bǔ)區(qū)域形成了RNA-RNA二聚體。這些結(jié)果說(shuō)明反義基因可能對(duì)咽側(cè)體抑制素基因的表達(dá)有著重要的調(diào)控作用。 總之，這是第一次在甲殼動(dòng)物中分離到編碼咽側(cè)體抑制素的基因，并研究了其組織分布與表達(dá)特征。同時(shí)本研究也是第一次發(fā)現(xiàn)咽側(cè)體抑制素基因存在天然反義基因，更為重要的是，本研究還發(fā)現(xiàn)正義基因與反義基因的